菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响.docxVIP

菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取和纯化方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、掌握菠萝蛋白酶的化学修饰并对修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（Bromelain,EC 3.4.22.3）是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为33000D，等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。菠萝蛋白酶的最适温度范围比较稳定，最稳定范围是55℃~65℃。菠萝蛋白酶的最适 pH 在 7.1 左右，呈现中性。金属盐离子中 NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，较高浓度的 MgCl2、CaCl2对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度的抑制作用，尤其在浓度较高的情况下对菠萝蛋白游离酶酶活的影响更大。Zn2+的作用中以醋酸锌的作用更为显著，极低的浓度即能促使菠萝蛋白酶的酶活性明显提高。较低浓度的 ZnCl2也能使酶的稳定性有所提高。 维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力。0.05%的苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶的活性得到抑制，对酶起到保护作用。对酶活有影响的金属离子，EDTA 能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶的失活作用。其它试剂如 50%的甘油、葡萄糖、40%的半乳糖都能使菠萝蛋白酶的半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定的保护作用。菠萝蛋白酶含有1个巯基和4个内肽二硫键。在蛋白质中 , —SH 部分是与酶活性有关的最具有反应性的官能团，巯基能够和N取代马来酰亚胺反生加成反应，可以对巯基进行修饰，验证巯基对酶催化活性的影响三、试剂材料1、材料：新鲜的成熟菠萝2、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙的干燥器、CM琼脂糖凝胶柱（1.1cm×30.0cm）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、PH计、搅拌棒。3、试剂：0.2%单宁、5%苯甲酸钠溶液、0.1%/0.5%EDTA 溶液、1.5%氯化钠溶液、20mMpH4.0的醋酸缓冲液、1MNaC-20mM pH4.0醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）、三氯乙酸溶液、0.1M盐酸、0.1M氢氧化钠、50%乙二醇溶液、50%甘露醇溶液、50%葡萄糖溶液、50%甘油溶液、O.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)、N-乙酸顺丁烯二酰亚胺（NEM）（A.R.）PBS缓冲液：称取KH2PO42.69g及K2HPO413.97g，加水溶解后，定容至1000mL即得。酪氨酸溶液：精确称取105 ℃下干燥至恒重的酪氨酸5mg，用pH7.4磷酸缓冲液定容至100ml。酪蛋白溶液：精确称取酪蛋白5mg，用pH7.4磷酸缓冲液定容至100ml。酶激活剂：20mmol/L半胱氨酸盐酸盐，1mmol/LEDTA-Na, 用pH7.4磷酸缓冲液定容至100ml。蛋白酶液：精确称取菠萝蛋白酶1g，用pH7.4磷酸缓冲液定容至1000ml。四、实验步骤1.菠萝蛋白酶提取纯化1.1. 澄清菠萝汁的制备 将菠萝在清水中洗净，沥干，用压榨机压出汁液。用四层纱布挤压进行渣汁分离，获得的粗汁液再经四层纱布过滤去除纤维状物质。得到的粗滤液在 4℃下 3000rpm 离心 10min，留上清液备用。 1.2. 硫酸铵沉淀 取澄清的菠萝皮汁在 4℃磁力搅拌作用下缓慢加入经过研磨的固体硫酸铵至饱和。当硫酸铵全部加入后要不断搅动10min，以使溶解的蛋白和聚集的蛋白达到平衡。将此富含酶蛋白的溶液于5000rpm 离心 5min，收集沉淀并分离出上清液。1.3.透析除硫酸铵 1.3.1透析袋预处理： 将透析袋剪成适当长度，置于含1mmol/LEDTA 的 2%NaHCO3溶液中，煮沸10min。用去离子水彻底清洗透析袋后，再用1mmol/LEDTA 溶液煮沸 10min。冷却后，于 4℃保存备用。1.3.2操作步骤： 将商品化的透析袋适当处理后，封住一端，用纯水检查其完整性，然后将上述沉淀用少量缓冲液溶解后，装入透析袋，赶出袋中的空气，封住透析袋的另一端，放进 1000mL 烧杯中，下置电磁力搅拌器缓慢搅拌，4℃透析过夜，对该缓冲液透析，换液 3-4