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中国试剂网 3.15.2.10 蛋白纯化策略 （六）兴风作浪的乳糖(lactose) 晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是 Bill Studier 的报告。本来这 个报告是后来才听到的，但是由于 Burgess 的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达 蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier 这老哥是 Brookhaven National Laboratory 的，一生研究T7 噬菌体，也是 T7 RNA polymerase induction system(pET 系列质 粒) 的发明者。 T7 系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们 的不可能不知道这个系统。长话短说，pET 系列的质粒都用 T7 promoter 来控制 基因的表达。T7 promoter 只能被 T7 RNA polymerase 识别，而这个咚咚大肠杆 菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经整合入了由 LacUV promoter 和 lac operon 控制的 T7 RNA polymerase 基因片断。如果在细菌培养基里面加入 IPTG, 来诱导 T7 RNA polymerase 的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系 统非常强大，原因 在于 T7 RNA polymerase 工作起来非常有效率，效率高到什 么地步呢？就是表达一个蛋白，表达量可以占到大肠杆菌总蛋白量的 50%! 大家 可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对大肠杆菌有毒性，造成的 结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。 这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白,而且估计这个蛋白会形成包 涵体。妖怪的是，用质粒转化蛋白表达菌株 BL21(DE3)怎么也不能转化，铺的板 一个菌落也没有。我当时就怀疑是因为表达的蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本 底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了五六次，最后终于找到了 唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想过 本底是怎么来的。 这个问题到了 bill studier 做报告之后，才真相大白。原来我们一般用的 LB broth 有三种成分，其中一种是 tryptone. Tryptone 是 caseine 的酶解产物，而casein 又 中国试剂网 3.15.2.10 是 milk 里提取而来。由于 milk 有乳糖(lactose)，tryptone 里面也有乳糖的污染。 Bill studier 研究发现即使很微量的 lactose 也能有效的诱导蛋白表达。原来如 此！！！ 所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的 media 做培养板就完事了。 有意思的是，细菌有一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的 glucose，细 菌会优先摄取 glucose,而不能摄取 lactose 。Bill studier 根据这个特点研究出一种 可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例的 glucose 和 lactose 。细菌首先 摄取 glucose，不摄取 lactose,当细菌长到一定密度，耗完 glucose 之后，就开始 摄取 lactose,从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二 天收细菌，提蛋白就行了。 最后 Bill studier 老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的 瓶颈, 如果有足够氧气在培养基里面, 大肠杆菌的密度可以从一般的 OD600 2~3 翻十倍到 20~30!要提高培养瓶的供氧，可以用 baffled flask 。这种flask 的瓶底边 缘有几处凹陷(类似于可乐塑料瓶底那样的形状) ，能有效增加空气培养基的混 合。 最后，详细内容可以见下列文献: Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005) （七）古怪的CDC6