第十一章酶工程.docVIP

专题五、酶修饰与生物酶工程 1．基本概念 酶制剂的大规模的工业应用，主要受到两条限制：一是酶离开生物的生理环境以后，往往变得不稳定，且工业用酶的反应条件与生理条件差别很大，不易充分发挥它的催化效率。二是自然酶的分离提纯技术常较繁琐、复杂，因而酶制剂生产成本高、价格贵。在基因工程末出现和技术水平还较低的时期，人们已在寻求用各种化学修饰和固定化的方法，来改善酶在工业应用时的各种性质。 现代酶工程是酶学基本原理与化学工程技术，基因重组技术有机融合的结果。它的长远目标是要通过遗传设计，应用基因重组技术，创造新的超自然的酶分子。 酶工程的主要研究内容有：自然酶的进一步开发和大规模应用，通过化学的和遗传学的修饰，进一步探求酶的结构与功能的关系；大力改善工业、农业、医学和科研用酶制剂的热稳定性、对氧的稳定性、对重金属的稳定性、对pH的稳定性，提高催化效率；改变反应的最适pH值等等。研究设计制造优质的超自然酶；研制模拟酶催化功能的催化剂。目的是获得高活力、高稳定性及高应用潜力的酶。 以上内容，从解决问题的手段来看，可以概括为化学和生物学两个大类型，分别称为化学修饰（化学酶工程）和生物酶工程，下面分别予以简要介绍。 2．酶的化学修饰 在酶工程中，酶的化学修饰,其目的主要在于加强酶的稳定性。对于医学上的治疗用酶，还有一个目的，是降低或消除酶分子的免疫原性。在基础酶学研究中，化学修饰法是探讨酶活性中心性质的重要手段。从应用角度考虑，目前酶蛋白化学修饰研究主要包括以下几个方面: ①金属离子置换修饰; ②大分子结合修饰; ③肽链有限水解修饰; ④酶蛋白侧链基团修饰; ⑤氨基酸置换修饰。 2.1金属离子置换修饰: 本技术的主要依据是: 有些酶蛋白, 金属离子对其活力有着明显的影响, 这些金属离子多数情况下是酶活性中心的组成部分, 改变金属离子, 就在很大程度上改变了酶活力。 用于酶分子修饰的金属离子, 主要是一些二价金属离子,如: Ca Mg Mn Zn Co Cu Fe等。金属离子置换法只能适合于那些本来就含有金属离子的酶蛋白。 酶分子修饰的基本过程 ①在酶溶液中加入一定量的乙二胺四乙酸(EDTA 金属离子螯合剂), 使其充分与酶蛋白中的金属离子进行螯合。 ②除去EDTA-金属离子螯合物 (透析法、超滤法、层析法等)。 ③加入新的修饰离子。 实例: 将含锌的蛋白酶中的锌离子除掉后, 加入钙离子, 可以使原酶蛋白的活力提高20-30%。 2.2 大分子结合修饰 利用一些水溶性大分子与酶蛋白结合, 改变酶分子的空间结构, 从而改变酶性质。 常用的大分子修饰剂有: 右旋糖酐、聚乙二醇、聚氨基酸、蔗糖聚合物等。 通过大分子结合化学修饰, 主要从以下几方面具有重要意义 ①提高酶活力, 例如: 核糖核酸酶, 利用右旋糖酐修饰后(一分子酶蛋白与6.5分子右旋糖酐结合后), 酶活力是原酶活力的2.25倍; 胰凝乳酶经右旋糖酐修饰后(一分子酶蛋白与11分子右旋糖酐结合), 酶活力是原酶活力的5.1倍。 ②增加酶蛋白的稳定性: 例如SOD---超氧化物歧化酶经化学修饰后, 酶稳定性有明显的改善和提高:见下表 SOD HALF-LIFE NATURAL SOD Ficoll-SOD PEG-SOD 6 min 14h 35h 2.3肽链有限水解修饰 利用肽链的有限水解, 使酶的空间结构发生某些精细的改变, 从而改变酶的特性和功能的方法, 称为肽链的有限水解修饰。 酶蛋白的肽链被水解后, 有以下三种情况: ①水解后, 引起酶活性中心的破坏, 从而酶的活性受到影响; ②水解后, 酶活性中心不受影响, 酶活力不发生改变; ③水解后, 使酶蛋白的分子结构发生改变, 更加有利于酶活性中心与底物结合和有利于酶的催化反应。 后两种情况, 可用于酶修饰, 第二种情况, 一般不改变酶活力, 主要用于对酶蛋白的抗原性进行修饰, 我们知道, 蛋白的抗原性主要与蛋白的结构的复杂性有关, 蛋白越复杂, 其抗原性越强; 在不影响酶蛋白的酶活力的前提下, 对酶蛋白进行有限水解, 减低其结构的复杂性, 从而降低酶蛋白的抗原性; 第三种情况, 在水解掉酶蛋白的部分肽段后, 酶活力有明显的提高, 主要用于提高酶活力的修饰。 酶修饰的实例: ①胰蛋白酶 胰蛋白酶主要产生于动物的胰脏, 在胰脏细胞分泌出来时, 是以胰蛋白酶原的形式存在, 不显示酶活力, 只有利用特异性蛋白酶水解后, 使胰蛋白酶原除掉一个6肽后, 才显示出酶活力。 ②天冬氨酸酶: 天冬氨酸酶经胰蛋