抗真菌、抗渗透胁迫基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化的研究.pdfVIP

试验研究2008．3 虐业斜姓ji抛 抗真菌 抗渗透胁迫基因多价植物 表达载体构建及对黄瓜遗传转化的研究 东 丽1,2 李 杰 朱延明’ (1．东北农业大学 哈尔滨 l50030；2．天津天隆种业科技有限公司 300457) 摘要：本研究以黄瓜为试材，建立黄瓜植株再生体系和遗传转化体系；构建了分别由双35S组成型 启动子、E12强组成型启动子和rd29A诱导型启动子调控的核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和 DREBIA基因的多价基因植物表达载体：利用农杆菌介导入法将其导入黄瓜优良品种，获得了转 pBDCR T 及T 代PCR阳性植株。T1代转基因植株的抗逆性实验表明，DREB1A基因的表达可 以提高黄瓜的抗旱性。本研究为培育抗逆境及抗真菌病转基因植株探索途径，并为进一步揭示核 糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和 DREBIA基因的分子机理提供 了理论依据。 关键词：黄瓜；c 和 基因；DREBIA；载体构建；遗传转化；分子检测 黄瓜在生产过程中常因各种病虫害的危害而使产 作用，此类基因已成为近年来植物分子生物学研究领 量和品质遭受不同程度的损失，尤其是黄瓜易受多种 域的一个前沿内容。 真菌病害的侵染，如黄瓜霜霉病(Pseudoperonospora 基于以上事实．本研究以黄瓜为试材，利用基因工 cubensis)，是黄瓜保护地和露地黄瓜最严重的流行病 程手段，将chitinase、rip两种抗真菌病的基因及胁迫 害．能在一两周内使植株大部分叶片枯死。一般年份造 信号传导过程中的关键基因DREB1A基因构建在一 成减产20％～30％，严重时可减产40％～50％；黄瓜枯萎 个植物表达载体上，采用农杆菌介导法将此植物表达 病(Fusarium oxysporum，=sp．Cucumerinum)，俗称“死 载体导入黄瓜，以期获得广谱抗真菌病及抗渗透胁迫 秧”，全国各地均有发生，一般减产5O％，严重时可导 的转基因植株，并通过对转基因植株的生长发育状况 致绝产，成为保护地黄瓜生产的障碍因素之一；此外， 和抗逆性及抗真菌病分析检测DREB1A基因、chi基 还有黄瓜疫病 ( ytophthora melonis)、黄瓜灰霉病 因、rip基因在转基因黄瓜中的功能，这在提高黄瓜抗 (曰 w cinerea)、黄瓜炭疽病(Colletotrichum orbicu— 病性，保证其高产、稳产及保护环境等方面均具有十分 late)等。这些真菌病害给生产造成极大损失。干旱、盐 重要的意义，也为黄瓜的抗渗透胁迫和抗病育种提供 渍、低温等逆境胁迫常常影响植物的生长和发育，造成 新途径。 作物严重减产。因此，如何通过改善植物的抗逆性及提 1 材料与方法 高水分和营养利用效率来增加粮食产量和节约资源， 1．1 植物表达载体构建 已成为我国农业持续高效发展的重大需求。 1．1．1 材料 几丁质酶基因(chi)和核糖体失活蛋白基因(rip)都 1．1．1．1 菌株和质粒 大肠杆菌菌株：大肠杆菌 具有抗真菌功能并具有协同抗真菌的作用。几丁质酶 DH5eL、JM109。根癌农杆菌菌株：LBA4404(pAL44041。 能够水解真菌菌丝的细胞壁．核糖体失活蛋白通过作 质粒：质粒pUC18、pCD29A、pBCE12、pARIP均由东北 用于真菌核糖体28S rRNA来阻碍真菌蛋白质的合成， 农业大学植物生物工程研究室保存：质粒pUD29A、 如果核糖体失活蛋白基因与几丁质酶基因一同导入植 pBCR、pBDCR南本研究构建。 物．几丁质酶降解真菌细胞壁而使核糖体失活蛋白更 1．1．1．2 常用试剂及酶类 限制性内切酶、T4DNA 易进入真菌细胞，可产生更强烈的抑菌作用。研究表明， 连接酶、DNA片段回收试剂盒均购自大连宝(TaKaRa1 DREB fdehvdrati0nresp0nsive element binding protein)转 生物工程公司。卡那霉素、氨苄青霉素等均为国产试 录因子是一个干旱应答元件的结合蛋白．它在植物对 剂，其他试剂均为分析纯。 干旱、高盐及低温胁迫的分子反应中起着重要的调控 1 1 2 方法