RuBP羧化酶活性测定.docxVIP

RuBP羧化活性一、实验目的RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶(RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco）。Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。在叶绿素间质中浓度300mg/ml。同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。二、实验原理Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下： RuBP+CO2+H2O2(3-PGA) 3-PGA+ATP1,3-二磷酸甘油酸+ADP 1,3-二磷酸甘油酸+NADH3-磷酸甘油醛+NAD++PO4－3通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。三、实验材料、试剂及仪器实验材料：新鲜的小麦叶片、新鲜的玉米叶片实验仪器：匀浆器、研钵，移液管、研钵、冷冻离心机(eppendorf Centrifuge 5417R)、分光光度计(SHIMADZU UVmini-1240)、秒表、石英、微量比色杯等。反应介质：RuBP羧化酶提取液反应液磷酸肌酸激酶溶液磷酸肌酸溶液3-磷酸甘油酸激酶溶液3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液NADH溶液RuBP溶液ATP溶液四、实验步骤1.酶粗提液制备。（1）称取新鲜小麦叶片0.1g；（2）置于研钵中加入1ml提取液；（3）研磨成匀浆后，转移至1mL离心管；（4）在12000Pa、4℃下离心10min，取上清液，即为酶液；（5）取上清液即为粗酶提取液。置冰上保存备用。2.叶绿素测定。（1）称取0.1g叶片剪碎，置于研钵中；（2）加入80％丙酮，研磨成匀浆；（3）过滤后，置于10mL容量瓶并定容至10mL；（4）在645nm和663nm处测定吸光值，加入无水丙酮调零；（5）计算叶绿素a、b总含量Ch1(a+b)。3.活力测定。各试剂加入量及顺序，按照下表配制反应体系:试剂加入体积（ul）反应液630磷酸肌酸50磷酸肌酸激酶503-磷酸甘油醛脱氢酶503-磷酸甘油酸激酶50ATP50RuBp(340nm调零)50酶提取液20NADH50将配好的反应体系摇匀，倒入比色杯中，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上测定340nm处的吸光度，作为零点值。将0.1mlRuBP加入比色杯中，并立刻计时，每隔5S测定1次吸光度，共测1min。以零点到1min内吸光度下降值计算酶活力。五、结果计算1.Rubisco酶活力计算公式RuBp活力=μmol/(min·mg·chl) =△A·V（反应）/(2dε·V(样品)·△t·Chl(a+b)·Fw)△A:1min内吸光值变化d:光径（cm）=0.4V(反应):反应液体液1mLε:μmolNADH在340nm处的摩尔消光系数6.22△t：时间间隔（min）=1Fw:叶片鲜重=0.0985g(玉米)、0.0969（小麦）Chl(a+b):叶绿素总含量mg/gV(样品)：酶液总体积（0.02mL）2为每固定1molCO2有2molNADH被氧化。叶绿素含量计算Chl(a+b)浓度（mg/L）=（12.72A663-2.59A645）+（22.88A645-4.67A663）=20.29A645+8.05A663由实验数据带入公式得出（单位nm)：小麦叶片叶绿素提取液在645nm和663nm处的吸光值分别是:0.501和1.040玉米叶片叶绿素提取液在645nm和663nm处的吸光值分别是:0.568和1.173小麦叶片叶绿素浓度=(20.29*0.501+8.05*1.040)=18.54mg/L玉米叶片叶绿素浓度=(20.29*0.568+8.05*1.173)=20.97mg/L叶绿素含量（mg/g）=(Chl(a+b)浓度·V体·稀释倍数)/Fw其中稀释倍数为1；V体=0.01L；FW小麦=0.1010；FW玉米=0.1001代入叶绿素含量公式，计算得出小麦叶绿素含量为1.836mg/g，玉米叶绿素含量为2.095mg/g。 3.实验结果 表为玉米和小麦在1min中吸光度数值的变化过程样品0s5s10s15s20s25s30s35s40s小麦0.2750.2740.2720.2710.2700.2680.2670.2660.265玉米0.3750.3720.3690.3670.3650.36