红树林来源Streptomyces sp.OUC6819中Drimentines类化合物生物合成探究.pdfVIP

Streptomyces sp.OUC6819 Drimentines Streptomyces sp.OUC6819 Drimentines 红树林来源SSttrreeppttoommyycceess sspp..OOUUC中DDrriimmeennttiinneess 类化合 物生物合成研究 摘 要 Streptomycessp. OUC6819 分离自我国南海红树林底泥之中，前期研究结果 表明该菌株能够产生Drimentines 类化合物。该类化合物具有terpenoid-DKP 的杂 合结构，并有广泛而显著的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、杀昆虫和杀寄生虫等生物 活性，Drimentines 的独特结构与显著活性引起了科学家的关注。本论文以南海 红树林链霉菌Streptomycessp. OUC6819 为研究对象，对其中Drimentines 类化合 物的生物合成进行了初步研究，取得了以下研究结果： 1.以SuperCos1 为载体，构建了Streptomycessp. OUC6819 的基因组文库。 提取Streptomycessp. OUC6819 基因组DNA，并用Sau3AⅠ进行部分酶切后，脱 磷，回收30-50kb 基因组片段，与经XbaⅠ酶切脱磷后并用BamHⅠ酶切处理的 SuperCos1 相连，经噬菌体包装后侵染E.coliTrans10，构建成基因组文库，对构 7 建成的文库的质量进行鉴定，文库随机性良好，效价为0.6×10 cfu/mL，达到建 库要求。这为基因簇的克隆、基因功能研究与异源表达奠定了基础。 2.结合Drimentines 化学结构信息及生物信息学分析，从Streptomycessp. OUC6819 基因组扫描序列中定位了可能的Drimentines 生物合成基因簇，从 Streptomycessp. OUC6819 的基因组文库中克隆了该基因簇，并进行了基因组成 与基因功能预测。推测该基因簇共33kb，其中包含了23 个开放阅读框(Opening Reading Frames,ORFs) ：driB,C,D,E,F基因可能与倍半萜结构的合成相关， driK,M,N,O,P,V基因可能参与二酮哌嗪骨架合成，driJ,L基因负责合成色氨酸， 并含有driA,Q,T,W四个调控基因及可能与抗性相关的driS。通过菌落PCR 对基 因组文库进行筛选，筛选得到6 个阳性克隆。 3.采用PCR-targeting 策略，构建了用于基因driB（编码聚异戊二烯焦磷酸合 酶）阻断双交换的重组 cosmids ，并将 driB重组 cosmid 转入 Streptomyces sp.OUC6819 中，得到了driB基因阻断突变株。采用放线菌Ⅱ号培养基对野生型 菌株和△driB突变株进行发酵，发酵产物HPLC-MS 检测分析表明，△driB突变 株丧失了产生Drimentines 类化合物的能力，证明driB基因在Drimentines 生物 合成中是必须的。 4.进行了 Drimentines 生物合成基因簇的异源表达研究。将可能包含 Drimentines 整个生物合成基因簇的Cos4 经不同程度的修饰改造之后，通过接合 转移导入天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）M1152 之中，将接合子用放线 菌Ⅱ号、R2YE 及稀有培养基进行发酵，所得发酵产物进行HPLC 分析，但未检 测到Drimentines 类化合物或其结构类似物的产生，推测有可能是基因未表达， 或基因簇不完整。 5.初步研究了driM基因的体外催化活性。生物信息学分析表明，driM可能 与Drimentines 中二酮哌嗪结构的合成相关。将driM重组表达质粒导入E.coli CodonPlus(DE3)中，在16℃，0.4mM IPTG 诱导条件下，实现了可溶性表达，纯 化后，初步检测了其催化活性。对几种检测的氨基酸催化活力进行比较发现， DriM 具有比较广泛的底物识别能力，在高浓度底物时，DriM 对所测底物都表现 出了催化活力。 以上研究结果为进一步展开Drimentines 生物