富集宏基因组dna中α淀粉酶全长基因的克隆及重组表达.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（３）：５６６０ ? 富集宏基因组ＤＮＡ中 淀粉酶全长基因的 α 克隆及重组表达 １，２ １，２ １，２ １，２ １ １ １，２ 杨　键 　曾丽娟 　廖思明 　王青艳 　杜丽琴 　韦宇拓 　黄日波 （１广西大学生命与科学技术学院广西亚热带生物资源保护利用重点实验室　南宁　５３０００５） （２广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心　南宁　５３０００７） 摘要　利用反向巢式ＰＣＲ（ＩＮＰＣＲ）从富集土壤宏基因组ＤＮＡ中克隆到一种 淀粉酶基因的全 α 序列，其基因登录号为ＧＵ０４５５２３，测序分析显示与来自Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＫＲ８１０４耐酸淀粉酶不完整 基因同源性为９９％。将获得的 淀粉酶成熟肽基因与表达载体ｐＳＥ３８０连接，导入Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ α ｃｏｌｉＪＭ１０９中，ＩＰＴＧ诱导表达。粗酶液经ＮｉＮＴＡ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００纯化后测定酶学性质：重组酶 ＧＸＡＡ的最适作用ｐＨ为７．０，最适作用温度为７５℃，对可溶性淀粉的Ｋｍ值为１１．６ｇ／Ｌ。构建突 变子Ｅ２７Ｇ、Ａ４５０Ｔ、Ｅ２７ＧＡ４５０Ｔ，其酶学性质与原始酶没有显著差别。 关键词　宏基因组　反向巢式ＰＣＲ　侧翼序列　 淀粉酶 α 中图分类号　Ｑ７８ 　　传统方法获得功能基因往往要经过菌种筛选、菌 公司；ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９为本实验室保存 种鉴定、基因文库构建与筛选等程序，不仅过程繁琐耗 １．１．２　酶和试剂　ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶购自ＴａＫａＲａ 公司；限制性内切酶、ＤＮＡ／Ｈｉｎｄ ｍａｒｋｅｒ、Ｔ４连接酶 时耗力，而且很容易丢失有价值的基因资源。宏基因 λ Ⅲ ［１］ 及ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｍａｒｋｅｒ均购自ＭＢＩ公司；其余 组技术显著改善了基因资源丢失的问题 ，但要从上 万克隆的文库中筛选功能基因工作量依然相当巨大， 为国产分析纯。 本实验室曾成功以富集宏基因组 ＤＮＡ为模板一步 １．１．３　土样　采自广西大学农场堆肥。 ［２］ １．１．４　培养基　芽孢杆菌富集培养基（每升含葡萄糖 ＰＣＲ法直接克隆功能基因 。然而对于已知部分序列 ８ｇ，蔗糖８ｇ，淀粉 １６ｇ，蛋白胨 １５ｇ，酵母膏３ｇ，ＫＨＰＯ 的基因，从环境中获得其全序列要面临更多的问题。 ２ ４ ２ｇ，ＭｇＳＯ０．６ｇ）。 　　 淀粉酶是一种重要的工业酶，被广泛应用于食品、 ４ α ［３４］ 　　ＬＢ培养基（每升含蛋白胨１０ｇ，酵母粉５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ， 纺织、洗涤剂及生物能源等行业。Ｓａｊｅｄｉ等 发现了一 调ｐＨ至７．０）培养基氨苄青霉素终浓度为１００ｇ／ｍｌ。 种耐酸性能优越且不依赖