一种酿酒酵母附加型分泌表达载体pyes2／ct／α-factor的 - 生物通.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１２）：４９～５３ 一种酿酒酵母附加型分泌表达载体 ｐＹＥＳ２／ＣＴ／ｆａｃｔｏｒ的构建及鉴定 α １，２ ２ 胡亚冬 　姚冬生 （１广州科仁生物工程有限公司　广州　５１０６００）　２暨南大学微生物技术研究所　广州　５１０６３２） 摘要　以ｐＰＩＣ９为模板，通过ＰＣＲ扩增获得酿酒酵母的 交配因子（ｆａｃｔｏｒ），并克隆至酿酒酵 α α 母胞内表达载体 ｐＹＥＳ２／ＣＴ中，构建了一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体 ｐＹＥＳ２／ＣＴ／ α ｆａｃｔｏｒ（ｐＹＣ）。再将甘露聚糖酶基因（ｍａｎｎａｓｅ，ｍａｎ）通过酶切、连接克隆至ｐＹＣ 的 ｆａｃｔｏｒ的下 α α α 游，构建了ｐＹＣｍａｎ重组载体检验ｐＹＣ 的分泌性能和稳定性。结果显示 ｆａｃｔｏｒ可引导甘露 α α α 聚糖酶基因在胞外分泌表达，在曲利本兰培养基上形成明显的水解圈，进一步分析重组菌胞外和 胞内酶活，结果显示对照ＩＮＶＳｃ１／ｐＹＣ 的两种酶活都未检测到，而ＩＮＶＳｃ１／ｐＹＣｍａｎ具有明显 α α 的胞外酶活，未检测到胞内酶活，说明构建的ｐＹＣ 具有良好的分泌性能；稳定性实验表明重组质 α 粒连续培养１５０ｈ仍具有良好的稳定性。 关键词　酿酒酵母　信号肽　分泌表达 中图分类号　Ｑ７８２ 　　酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）是一种最简单 好的外源蛋白表达途径。 的单细胞真核生物，但和其他复杂真核生物一样拥有 　　 目前常用的商用酿酒酵母表达载体主要如 很多细胞器结构，具有复杂的翻译后修饰功能，再加上 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ｐＹＥＳ系列、ｐＹＣ系列和ＡＴＣＣ的ＹＥＰ 易培养的特性，酿酒酵母被用作研究真核生物的模式 系列、ｐＢＴ系列等，但这些载体全部为胞内表达载体，不 生物，它的遗传背景和生理特性也日益清晰。因其具 适应胞外分泌表达的需要。而稳定、分泌性能好的附 有翻译后修饰功能，自上世纪 ［１］ ８０年代Ｈｉｔｚｅｍａｎ 首次 加型表达载体是定向进化的重要工具。因此，本研究 利用酿酒酵母表达人干扰素基因获得成功后，许多来 以酿酒酵母胞内表达载体ｐＹＥＳ２／ＣＴ为构建基础，选择 源于真核生物的蛋白在酿酒酵母中获得活性表达。酿 来源于酿酒酵母的 交配因子即 ｆａｃｔｏｒ为信号肽，将 α α 酒酵母因其清晰的遗传背景和培养易控制的优点，还 之克隆至ｐＹＥＳ２／ＣＴ上，以构建酿酒酵母附加型分泌表 ［２，３］ 是定向进化研究常用的真核表达宿主 。定向进化 达载体，得到一种高效的分泌表达系统，为外源蛋白在 研究中，重组子筛选是其中一个关键环节，筛选方法的 酿酒酵母中的分泌表达和定向进化研究提供重要的载 简便和快速决定了定向进化的成败。显然，胞