肺炎链球菌sp0306蛋白的表达纯化及结晶研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（６）：２１２５ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 肺炎链球菌ＳＰ０３０６蛋白的表达纯化及结晶研究 １ ２ １ １ １ 黄　健 　黄美容 　朱杰华 　骆诗露 　闵　迅 （１遵义医学院附属医院检验科　遵义　５６３００３　遵义医学院附属医院输血科　遵义　５６３００３） 摘要　ＳＰ０３０６蛋白是肺炎链球菌ＴＩＧＲ４菌株中的一种假想的转录因子，但其蛋白三维结构及生 物学功能尚未明了，生物信息学分析提示其可能调控碳水化合物代谢相关基因的表达。成功构 建了ＳＰ０３０６蛋白的全长表达载体ＰＥＴ２８ａｓｐ０３０６，利用大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株进行原核表达， 获得了以可溶形式表达的目的蛋白。经ＮｉＮＴＡ柱亲和层析及ＤＥＡＥ阴性离子交换层析纯化后， 获得了高纯度的目的蛋白。采用悬滴气相扩散法获得了质量较好的ＳＰ０３０６蛋白晶体，并初步进 行了晶体Ｘ射线衍射，为其最终的三维结构解析及生物学功能研究奠定了基础。 关键词　肺炎链球菌　ＳＰ０３０６蛋白　原核表达　晶体生长 中图分类号　Ｑ８１９ 　　肺炎链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓ．ｐｎ）是引起细 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株、ＰＥＴ２８ａ质粒均为本室保存。 菌性肺炎、中耳炎、脑膜炎等疾病的一种常见致病菌。其 １．２　试　剂 在婴幼儿及老年人中具有较高的发病率与死亡率，全世界 　　细菌基因组 ＤＮＡ提取试剂盒购自北京天根生化 ［１］ 每年约有１６０万人死于与Ｓ．ｐｎ感染相关的疾病 。毒力 科技有限公司；Ｐｒｉｍｅｒｓｔａｒ高保真ＤＮＡ聚合酶，限制性 因子在肺炎链球菌致病过程中扮演着较为重要的作用，其 内切酶ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ，ＴＤＮＡ连接酶购自大连宝生物 ４ 重要的毒力因子包括荚膜多糖和许多毒力蛋白，如肺炎链 工程有限公司；ＨｉｓＢｉｎｄＣｏｌｕｍｎ（ＮｉＮＴＡ）树脂、ＤＥＡＥ 球菌表面蛋白ＰｓｐＡ、ＰｓｐＣ，ＰａｖＡ等在肺炎链球菌粘附、侵 阴离子交换柱购自美国ＧＥ公司；蛋白晶体筛选试剂盒 ［２］ 袭等致病环节中发挥着重要作用 。针对不同感染进程 ＣｒｙｓｔａｌＳｃｒｅｅｎＫｉｔＩ＆ＩＩ及ＰＥＧｓｃｒｅｅｎＩ＆ＩＩ购自美国 的需要，肺炎链球菌会调控许多毒力基因的表达，以利于 ＨａｍｐｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ公司。 其建立感染及适应宿主局部微环境。其中，转录因子在毒 １．３　生物信息学分析 ［３］ 力基因表达调控过程中起着非常重要的作用 。因此，研 　　本研究采用 ＮＣＢＩ保守结构域在线分析软件 究肺炎链球菌毒力基因的转录调控机制，对于预防与控制 （ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＳｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ），分析 ＳＰ０３０６蛋白 肺炎链球菌感染有重要意义。ＳＰ０３０６蛋白是肺炎链球菌 结构域以预测其可能的生物学功能。 中的一种功能未知的转录因子，为研究其生物学功能，本 １．４　ＳＰ０３０６蛋白原核表达载体构建 研究拟对ＳＰ０３０６蛋白进行原核表达、纯化及晶体生长，并 　　以肺炎链球菌ＴＩＧＲ４菌株基因组ＤＮＡ为模板，以 对挑选其蛋白晶体进行Ｘ射线衍射，为最终解析出蛋白三 上游引物：５′ＣＧ