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PCR相关资料 1、PCR实验技术【原理】 PCR（polymerase?chain?reaction）用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约15-20个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域；③4种dNTP；④Tag?DNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌（Thermus?aquaticus）中分离出来的。此酶最适作用温度为75～80℃，但短时间在95℃下不失活。⑤适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。反应过程：①变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约90-95℃）使DNA双链解离；②复性：降温（约60℃左右）退火，使引物与模板结合；③延伸：升温度至70-75℃，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段；④重复上述“变性——复性——延伸”的过程。最初几次循环中形成的长链DNA较多，但随着反应的进行，长链DNA以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标DNA以指数级数增长，经大约20—30次循环后，扩增产物中主要是目标DNA。 【材料】 1.?试剂和溶液? （1）10?×?PCR缓冲液 500?mM?氯化钾 100?mM?Tris-Cl?(室温时pH?8.3) 15?mM?氯化镁 （2）10?mM脱氧三磷酸核苷(dNTPs)?溶液－含有所有四种dNTPs(pH?8.0) （3）耐热的DNA?聚合酶： ①?Taq?DNA?聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA?聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有5’→3’?DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’?外切酶活性。此酶由分子量约为94?千道尔顿的多肽组成。Taq?DNA聚合酶对热稳定，能在较高的温度下利用引物将单链模板合成为DNA。?催化一典型的PCR所需酶量约为2单位。加酶量过多则有可能导致非靶序列的扩增。 Taq?DNA?聚合酶缺乏校正功能，在PCR过程中核苷酸掺入错误率可达每循环2?×?10-4个核苷酸，约比使用大肠杆菌DNA聚合酶?I?的Klenow片段时高4倍。对于一个30轮循环的扩增反应来说，这一掺入错误率将导致0.25％的总错误频率。这一频率似随和浓度的升高而增大。这些错误的掺入可以发生在扩增产物的任何位置，既有颠换也有转换（但并无长的缺失、嵌合或插入）。 单位的定义：一单位是指于74oC将l0?nmol的脱氧核糖核苷酸30分钟内掺入到酸性沉淀的物质中。其实验条件是：25?mM?TAPS?(pH9.3),?50?mM?氯化钾,?2?mM?氯化镁,?1?mM?DTT,?0.5?mg/ml?有活性的鲑鱼精液DNA,?0.2?mM?dATP,?dCTP,?dGTP,?dTTP。 ②?rTth?DNA聚合酶是Thermus?thermophilus(Tth)和Thermococcus?litoralis(Tli)两种菌中耐热DNA聚合酶的混合。这种混合酶特别具有5’→3’DNA?聚合酶和3’→5’外切酶（校正）的双重活性。当按推荐量使用时，此酶可提高保真度及长链PCR的产量。 常规PCR扩增靶DNA序列一般在5?kb以内。而rTth?DNA?聚合酶可从人类基因组DNA中扩增至19.6?kb的β－球蛋白基因群和噬菌体λDNA的42?kb的片段。? （4）琼脂糖凝胶 （5）10?μM的上游和下游引物 （6）DNA模板 （7）对照DNA（含有靶序列的DNA） （8）DNA长度标准参照物 2.?设备 （1）0.2?ml?PCR扩增管 （2）可预先设定扩增方案的温度循环器(PCR仪) 【方法】 方法一、基本的PCR方法 下面介绍的基本PCR方法可作为任何PCR扩增的一般指导和出发点。由于各种PCR反应条件（如PCR扩增次数、温度、Taq?DNA聚合酶的浓度、引物、氯化镁以及模板DNA）变异极大，应根据具体情况，对各种PCR反应条件进行相应调整。 1．按以下次序，将各成分加入0.2?ml灭菌扩增管中： 成分?????????????????????体积?????????????????终浓度 10?×?PCR缓冲液????????????????5?μl????????????????????1?× 10?mM?dNTP溶液(pH?8.0)?????????1?μl?????????????每种0.2?mM 10?μM?上游引物?????????????????2.5?μl????????????????0.5?μM 10?μM?下游引物?????????????????2.5?μl????????????????0.5?μM 5单位/μl?耐热DNA聚合酶????????0.5?μl??????