关于2.基因工程-1酶.pptVIP

* * * * * * 5. Taq酶等 活性：（1）5??3?聚合酶活性 （2）3??5?外切核酸酶活性 主要用途：耐热，最适温度75 ?C，专用于PCR 出错率1.1×10-4 此外，PCR经常用用到各种高保真酶如： Pfu DNA 聚合酶 和Pyrabest聚合酶 等 6.逆转录酶： 源于AWV (鸟成髓细胞白血病病毒)， 或Mo-MLV(Moloney鼠白血病病毒) 活性： (1) 5??3?聚合酶活性 (2) RNaseH活性(即外切RNA酶活性) 主要用途：反转录合成cDNA第一条链 * 7.末端转移酶作用:无模板的情况下，在DNA或RNA3’羟基上加dNTP主要用途：(1)载体或cDNA加同聚尾(100nt) (2)DNA的3’OH末端同位素标记 * DNA聚合酶的用途： 1）DNA分子的标记 2）DNA的序列分析 3）DNA的末端修饰 4）合成双链cDNA 5）定点突变 6）基因扩增（PCR技术） * 三、RNA聚合酶（RNA polymerase） 催化RNA体外合成反应 分类：依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶 36 四、DNA连接酶（DNA Ligase） 定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。 对底物的要求：dsDNA分子，具3’-OH末端和5’-P末端 用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制 和损伤后的修复中都起关键作用。 37 1. T4 DNA Ligase 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子 反应条件：1）温度 粘端4℃，平端25℃ 2）pH7.5-8.0 3）阳离子 Mg2+ 4）辅因子 ATP 38 2. E.coli DNA Ligase Mr=74000, NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。 39 3. T4 RNA Ligase 由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途:对RNA进行3＇末端标记。 40 T4多聚核苷酸激酶：催化ATP的 ?-磷酸基到DNA或RNA的5’ OH主要用途:对缺乏 5‘-磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化; 对5’OH末端进行同位素标记 五、激酶(Kinase) 对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 41 六、碱性磷酸酶 去除核酸末端磷酸基团的酶.包括: 细菌碱性磷酸酶(BAP)  牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 虾碱性磷酸酶(SAP)主要用途: 去除DNA、RNA的5?磷酸根，防止片段自身连接;标记（5 端）前除 DNA 或 RNA 5 磷酸 42 * 七、核酸酶（nuclease） 以核酸为底物的水解酶 按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切酶或外切酶 5’-核酸酶或3’-核酸酶 常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、 RNaseA、RNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、 λ噬菌体外切核酸酶等。 许多核酸酶兼有内切和外切活性 * 2.RNA酶 内切核糖核酸酶,专用降解RNA 1.DNA酶 为DNA内切核酸酶,水解单链或双链 用途:(1)缺口平移标记探针时产生随机切口 (2)降解DNA * 3. S1核酸酶 作用:降解单链DNA或RNA(酶量小) 降解双链DNA(酶量大) 用途:(1)去除DNA突出端,切为平头 (2)切除cDNA发夹结构 4.外切核酸酶III(ExoIII) 作用:从双链 DNA3’OH 逐一降解单核苷酸 不降解单链DNA或3’突出的双链DNA 用途:系列缺失亚克隆 * 核酸酶的分类 内切酶