关于2-切片技术.pptVIP

透射电镜 扫描电镜 * * 以荧光免疫组织化学为例介绍 磨片 * HE染色 苏木精 Hematoxylin 碱性染料 被苏木精染成蓝色的特性称嗜碱性Basophilic，如：细胞核，核糖体，粗面内质网等 伊红 Eosin 酸性染料 被伊红染成红色的特性称嗜酸性Acidophilic 如：细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑面内质网） 中性或嫌色性 与两染料的亲和力都不强 * 1、取材 2、固定 3、漂洗 4、脱水 5、透明 6、透蜡 7、包埋 8、修块 9、切片 10、染色 石蜡切片HE染色操作步骤 * 常规石蜡切片H．E染色程序 (一)脱蜡至水 1．二甲苯Ⅰ?????????? ?5-15分钟 2．二甲苯Ⅱ??????????? 5-15分钟 3．无水乙醇?????????????? 3分钟 4．95％酒精?????????????? 3分钟 5．80％酒精?????????????? 3分钟 6．70％酒精?????????????? 3分钟 7．自来水洗 ? (二)染色 1．Harris苏木素液?????? 5-7分钟 2．自来水洗?????????????? ???5分钟 3．1％盐酸溶液分化??? 30秒 4．自来水洗????????????????? 5分钟??? 5．1％氨水返蓝????????????10秒 6．自来水洗???????????? ?15-20分钟 7．95％酒精???? ?????????????3分钟 8．1％伊红酒精溶液????1-2分钟 ? (三)脱水、透明和封固 l．95％酒精???????????2分钟 2．无水酒精Ⅰ???????2分钟 3．无水酒精Ⅱ???????2分钟 4．二甲苯Ⅰ????????????5分钟 5．二甲苯Ⅱ????????????5分钟 * 染色 …manually …automated * HE染色 * 注意事项 任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色，石蜡切片要求平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏，与二甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。 在H．E染色过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不当致使应该分化脱色的部分末予脱去，或分化不足致染色不均匀，复染对也不能得到对比鲜明的色彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是，染色的成败除染色技术以外，组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛中的组织，由于过度酸化都会影响染色；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等均会使染色模糊。 伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一定要彻底，否则，影响透明。 脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。透明应注意时间充足，才能达到良好效果。封片时，中性树胶不能滴加太多或太少。封固好的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中40-50℃烘烤15小时左右，有利于切片的保存。 * 组织化学术(histochemistry ) 组织化学术(histochemistry )为应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术,与组织学技术相结合而产生的技术,能在组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否、以及分布状态.还可进一步用显微分光光度计或图象分析仪测定光镜切片中该物质反应的强度,获得定量的信息.应用这种技术于游离细胞的样品(如细胞涂片),则称细胞化学术(cytochemistry ). * 一般组织化学术 一般组织化学术 基本原理是在切片上加某种试剂,和组织中的待检物质发生化学反应,其最终产物或为有色沉淀物,以用光镜观察,或为重金属沉淀,以用电镜观察. * ⑴糖类:常用过碘酸希夫反应(periodic acid Schiff reaction ,PAS 反应)显示多糖和糖蛋白的糖链.糖被强氧化剂.过碘酸氧化后,形成多醛;后者再与无色的品红硫酸复合物(即希夫试剂)结合,形成紫红色反应产物. * PAS反应阳性 过碘酸Schiff反应(periodic acid Schiff reaction) ，是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。 氧化 Schiff试剂 多糖 → → 醛 → → → → 紫红色沉淀 * ⑵脂类:标本用甲醛固定,冷冻切片,用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色,使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色.亦可用锇酸固定兼染色,脂质呈黑色. * ⑶核酸: 显示DNA的传统方法为孚尔根反应(Feulgen reaction) .切片先经稀盐酸处理,使DNA分解;再用希夫试剂处理,形成紫红色反应物. * 如果同时显示DNA和RNA,则用甲基绿-派若宁反应.甲基绿与细胞核DNA结合呈蓝绿色,派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红