要点流式细胞术20111016.pptVIP

CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示对化疗药物耐药 四、肿瘤耐药基因分析 五、AIDS病检测中的应用 * HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As) 患者 六、自身免疫病相关HLA抗原分析 * FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。 七、移植免疫中的应用 * 小 结 流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。 FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。 同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。 * 第四节 流式细胞术的科研应用 细胞表型分析 胞内细胞因子的检测 染色体分类研究 细胞周期和DNA倍体分析 流式标准小球定量 分选 细胞内钙离子测量 * 流式应用常见范围 细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53，Foxp3 细胞功能检测：细胞周期、凋亡 * 抗体标记的方法 * 抗体的选择 首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适合弱抗原的检测 * 实验对照的设计 空白对照：单独细胞 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正） 阳性对照：检测阴性时 * 空白对照和阴性对照的比较 * 实验标本的处理 单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体 * 流式检测应用 淋巴细胞亚群分析 细胞周期 凋亡 细胞内分子检测 * T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 淋巴细胞及其亚群的分析 * 正常血细胞及其分化发育过程中免疫标志变化特点 常用各系血细胞CD抗原 1、T系：CD1-CD8（CD6不用） 2、B系：CD10, CD19-CD24, FMC7 3、髓系：CD11b,CD13-CD16,CD33,CD64 4、干祖：CD34, CD117, CD38, HLA-DR * 细胞周期 G1 M G2 S G0 反映相对DNA含量： 　二倍体 　异倍体：非二倍体，包括近二倍体，四倍体，　 　多倍体，非整倍体 * 细胞周期 Sub-G0/G1 peaks 不能区分凋亡与死亡细胞 四倍体峰 二倍体峰 * 凋亡细胞的特点 在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏 * Caspases检测 * Annexin V 法 更适用于悬浮细胞 * Annexin V-PI染色区分死亡与凋亡 死亡 晚期凋亡 早期凋亡 活细胞 * TUNEL法 * * 胞内细胞因子染色 * Medium PMA/Iono 更好的反映免疫细胞的功能 * 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。 第五节 在免疫学检验中的应用 * T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 一、淋巴细胞及其亚群的分析 * 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞