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第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培养 1，植物细胞 （原代细胞培养，永生细胞系） 2，动物细胞 （单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养） 3，非细胞体系 （DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡 运输，细胞核装配等） 细胞提取物，细胞核提取物 * 原代培养 （primary culture）：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养（Passage）。 细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 * 表三、实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 Henrietta Lacks BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP2／0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 * 植物组织培养 动物细胞培养 细胞的克隆 * 二、细胞工程 1，细胞融合与杂交 植物细胞先去壁； 融合方式：仙台病毒或聚乙二醇介导，电融合等 同核融合细胞，异核融合细胞，染色体丢失 2，单克隆抗体技术 三、显微操作技术 1975年英国科学家Milstein and Kohler, 1984年获诺贝尔奖 B淋巴细胞 + 小鼠骨髓瘤 转移细胞核、细胞器、基因等 四、转基因、基因沉默、基因敲除、模式生物等 * 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 同核体：相同基因型的细胞融合而成。 异核体：不同基因型的细胞融合而成。 自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。 * 显微操作仪 * 显微操作示意图 * 单克隆抗体技术 * * 基因克隆技术 转基因生物 * Gene Chip * 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物 病毒 细菌 酵母 线虫 果蝇 斑马鱼 小鼠 拟南芥 人 * Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana * 二、电子显微镜 1，电镜基本知识和结构（波长小于0.1nm） 2，样品制备 （超薄切片，负染色，冰冻蚀刻，三维重构，扫描） 3，电镜种类 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜 * （一）透射电子显微镜transmission electron microscope, TEM 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。 * 透射电镜及其图像 * 表二、不同光线的波长 * * 2、制样技术 1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 * * * * 2）负染技术 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 Negative Stained Actin * 3）冰冻蚀刻 freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然