知识3-细胞生物学研究方法.pptVIP

对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 细胞生命活动 突变体分析 突变体分析 蛋白修饰分析 基因表达 多肽定性分析 生物信息学 序列测定 双向电泳分析 DNA分离与克隆 机器人技术 (robotics) 功能基因组学 蛋白质分离与制备 蛋白质组学 * Differential centrifugation Low speed High speed * （二）密度梯度离心 ? 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。 ? 类型：速度沉降、等密度沉降。 ? 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 ? 分离活细胞的介质要求： – 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； – 2）PH中性或易调为中性； – 3）浓度大时渗透压不大； – 4）对细胞无毒。 * 1、速度沉降velocity sedimentation ? 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 ? 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被 分离生物颗粒的最小密度。 ? 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降 系数以不同的速度沉降而达到分离。 * 2.等密度沉降isopycnic sedimentation ? 用途：分离密度不等的颗粒。 ? 特点： – 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。 – 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。 ? 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。 * Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation * 二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法 ?原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 * 三、特异蛋白抗原的定位与定性 ?免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 ?蛋白电泳(SDS) 与免疫印迹反应(Western-Blot) ?免疫电镜技术： ?免疫铁蛋白技术 ?免疫酶标技术 ?免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等 * * 四、细胞内特异核酸的定位与定性 ?光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） ?电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生素抗体相连的胶体金标记结合） 　　　　　　 ?PCR技术 * 分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 （一）原位杂交（in situ hybridization）。 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了免疫探针法。 * （二）Southern杂交 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限 制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段， 经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 ? 将RNA转移到薄膜上， 用探针杂交， 则称为 Northern杂交。 * PCR 技术 ? PCR即：polymerase chain reaction。 ? 反应体系：①样品DNA；②引物（primer），约15-20个 核苷酸；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，来自于嗜热 水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度75~80℃，短 时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+。 ? 反应过程： ①变性：约90-95℃； ②复性：约60℃左右； ③延伸：70-75℃； ④重复“变性——复性——延伸” 过程,20-30次循环。 * PCR原理 * 五、放射自显影技术 ?原理及应用： ?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； ?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 ?步骤： ?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） ———放射自显影 * 六．定量细胞化学分析技术 ? 显微分光光度测定技术（Microspec