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厚生科学研究費補助金（長寿科学総合研究事業） 分担研究報告書 高齢者関節疾患におけるヒトTh1細胞特異的転写因子Txkの発現の検討と Txkを用いた新規治療法の開発 主任研究者　 鈴木　登　（聖マリアンナ医大　免疫学?病害動物学） 　高齢者における関節リウマチ(RA)や変形性関節症(OA)などの関節疾患の原因解明と予防?治療法の開発を目指してヒトTh1細胞特異的転写因子Txkの発現と機能を検討した。これまでにRA滑膜浸潤リンパ球ではIFN-γの産生とTxkの発現亢進を認め、疾患対照として検討したOA滑膜ではIFN-γの産生もTxkの発現も認められなかった。RA滑膜浸潤リンパ球Txkの発現亢進を是正する目的で、ドミナントネガティブTxk発現ベクターを作成した。本年度は自己抗体産生が病態を構築するコラーゲン関節炎モデルを対象にTxk遺伝子投与の関節炎への影響を検討した。ドミナントネガティブTxk発現ベクター投与では関節炎は改善を認めなかった。一方、コラーゲン関節炎マウスでは野生型Txk発現ベクター投与で関節炎は軽快した。今回の検討ではコラーゲン関節炎マウスは抗コラーゲン自己抗体産生に基づくTh2疾患であり、このような自己抗体産生が顕著な患者においてはTh1細胞細胞を誘導する野生型Txk発現ベクター投与が関節炎の治療に応用できることを示している。 A. 研究目的 　本格的な長寿?高齢化社会を迎えた本邦においては、高齢者の快適な生活を維持?増進できる施策が望まれている。多発関節痛?関節炎をもたらすRAやOAなどの関節疾患は高齢者の日常的な活動性を低下させ、介護の必要度を増加させる。高齢者の関節疾患の原因解明と予防?治療法の開発は難治性疼痛の緩和につながり、高齢者の生活の質の改善と高齢者社会の活性化に必須である。 　これまでの内科的治療ではRAのみならずOAにおいても関節病変は確実に進行する。本研究ではこれらを克服するために新たな治療的アプローチを確立し、さらに各種薬剤でRA、OAの治療法の確立をめざす。RAでは免疫異常として関節に浸潤するTh1リンパ球が特徴的である。 　ヘルパーT細胞は、産生するサイトカインの種類によってTh1型とTh2型に分類される。Th1細胞はインターロイキン(IL)-2, 腫瘍壊死因子(TNF)-β、インターフェロン(IFN)-γなどを産生することでマクロファージを活性化し、細胞傷害性リンパ球を誘導し、おもに細胞性免疫に関わる。これに対し、Th2細胞はIL-4, IL-5, IL-10, IL-13などを産生しB細胞の増殖と分化を誘導し、抗体産生をもたらす。Th1/Th2細胞は、それぞれのサブセットの細胞が産生するサイトカインにより互いの活性を制御し合いながら生体の免疫応答のバランスを取るように働く。 　Th1/Th2細胞のバランスの崩れが様々な感染症、自己免疫性疾患やアレルギー疾患の発症や病態形成に関与している。例えば、代表的なヒトの全身性自己免疫疾患であるRAは関節滑膜を病変の主座とする慢性疾患である。そのためには、Th1/Th2細胞の分化を制御する機構を明らかにすることが重要であり、主任研究者はこのTh1/Th2細胞の分化に重要な鍵を持つTxkに着目し研究を続けている。 　Txkは、itk、Rlk 、Btk、 Bmxなどが属するTec familyチロシンリン酸化酵素の一つで主にTリンパ球に発現する。ヒトTh1、Th0細胞に特異的に発現し、IFN-γの産生を誘導し、Th1細胞の機能発現に重要な役割な転写因子として働く。昨年度にTxkの発現を抑制する目的でドミナントネガティブTxkの作製を行った。本年度は関節炎モデル動物としてコラーゲン誘発関節炎を作成しTxk遺伝子投与の治療応用の可能性を検討した。 B.研究方法 (1)ドミナントネガティブTxkベクターの作成 野生型Txk発現ベクターを鋳型として以下に示す突然変異体を作成した。それぞれの突然変異について、目的とする変異がプライマーの中央に位置するようにデザインしたプライマー一組（センス鎖とアンチセンス鎖）とPfuTurbo DNA ポリメラーゼを用いてTxk発現ベクターを増幅した。増幅した産物をDpnI制限酵素で処理し、鋳型とした野生型Txk発現ベクターを完全消化し、目的とする変異型ベクターを回収した。目的とする突然変異がベクターに導入されたことはDNAシークエンス解析から確認した。 (2)コラーゲン誘発性関節炎モデルマウスの作成：DBA1J(6週令雌)に牛II型コラーゲン100(gを完全フロイトアジュバントとともに尾根部皮内に投与し、3週後に同様の追加免疫を行い、関節炎を誘導した。 (3)txk遺伝子治療：コラーゲン誘発性関節炎モデルマウス作成