区分猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株和野毒株的gE—PCR方法的建立.pdfVIP

动物医学进展 。2008，29(11)：5-8 ProgressinVeterinaryM edicine 区分猪伪狂犬病病毒 gE基 因缺失疫苗株和 野毒株的gE—PCR方法的建立 张 莉，丁伯 良，王英珍，鄢明华 (天津市畜牧兽医研究所 ，天津 300112) 摘 要：根据编码猪伪狂犬病病毒 gE基 因保守序列 ，设计合成一对 引物，通过优化 PCR反应条件，成 功地从猪伪狂犬病病毒感染的细胞 中扩增出预期的 178bp片段，而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、 猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒 gE基因缺失株均未扩增出相应的片段，经PCR扩增产物测序鉴 定，证实了该扩增片段为预期 目的片段 ；敏感性试验表明，该体 系可检测到 10。TCID。的猪伪狂犬病病毒。 本方法的建立能够区分基 因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪 ，使猪伪狂犬病病毒的检测更为快速、准确。 关键词：伪狂犬病病毒 ；gE基 因；PCR 中图分类号：$858．28；$852．659．1 文献标识码 ：A 文章编号：1007—5038(2008)11-0005—04 伪狂犬病 (Pseudorabies，PR)是 由伪狂犬病病 分离株，由天津市畜牧兽医研究所实验室提供；PRV 毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的多种家畜和野 Bartha—K61株 (gE基因缺失株)、猪瘟弱毒疫苗株为 生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要特 市售伪狂犬病和猪瘟病毒疫苗 。 征的一种重要传染病[1]。猪是伪狂犬病病毒的主要 1．4 引物的设计 自然宿主。猪伪狂犬病病毒具有其他疱疹病毒的共 根据 MinA株 gE基因的保守区段设计 1组引 同特性，即动物一旦感染，病毒将在体内呈长期潜伏 物 PRV (gE)U3和 PRV(gE)L3，预期产物大小 感染状态，可存在数年甚至终生，很难清除。在应激 l78bp，引物序列如下 ： 条件下，潜伏状态的病毒能被激活，并引起复发性感 PRV(gE)U3：4655 I℃GGCATOGCCGACTAC— 染和向外散毒[2。gE基 因是伪狂犬病病毒的主要 CT 3 ； 毒力相关基因，而gE基 因缺失的 PRV弱毒株也是 PRV (gE)L3：6425CCACCGCCACAAAGAA— 世界各国广泛使用的PRV弱毒疫苗 ]。笔者拟建 CACG 3。 立能够区分猪伪狂犬病病毒 gE缺失疫苗株和野毒 1．5 不同样品中病毒核酸的提取方案 株的gE—PCR检测方法。 1．5．1 细胞培养物病毒 DNA 的提取 收获出现 l 材料与方法 典型病变的细胞 ，冻融 1次，4000r／min离心取上 l_l 细胞与培养基 清 445 L，加入 l2．5 L蛋 白酶 K(20mg／mL)和 PK一15细胞 ，由天津市畜牧兽医研究所实验室 25 L100mL／LSDS。50℃水浴 2h，酚、酚 ：氯 保存；MEM、小牛血清购 自GIBCO公司。 仿、氯仿各抽提 1次，吸取水相。2倍体积的无水乙 1．2 主要酶和试剂 醇在一20℃沉淀 1h后 ，i0000r／rain离心 10rain， TaqDNA聚合酶 、蛋 白酶 K、10×buffer缓冲 沉淀经 700mL／I乙醇洗涤，干燥后溶于 2O LTE 液、十二烷基磺酸钠 (SDS)、10mmol／L dNTPs、 中，一2O℃冻存备用[5]。 AMV酶、DNAMarkerDI2000均购 自宝生物工程 1．5．2 猪伪狂犬病可疑病料 中病毒 DNA的提取 (大连)有限公司；TrizolLSReagent购 自GIBCO公 将采集的猪扁桃体与脑组织分别在灭菌的乳钵内 司；其余试剂均为国产或进 口分析纯试剂。 剪碎，