两种重要鱼类致病菌感染及减毒活疫苗接种途径的研究.docVIP

　　两种重要鱼类致病菌感染及减毒活疫苗接种途径的研究 第1章文献综述 1.1水产养殖病害及疫苗 随着海水养殖规模扩大、养殖密度增加，细菌、真菌、病毒、寄生虫等病害不时在全国大范围暴发。目前，己知海水养殖病害200余种，每年因病害所致损失高达数百亿元。细菌性病害发病频率高、流行范围广、病原体易变异，成为限制我国水产养殖业发展的重要瓶颈。水产病害发生的主要原因是多方面的，比如抗生素和化学药物的滥用导致病原微生物耐药性增强，并产生多抗药性病原；馆料残留、排泄物沉积、污水排放等加剧养殖水体败坏；病害种类多、传播速度快，缺乏有效预防措施及防治药物；养殖品种退化，抗感染能力减弱等。针对水产养殖现状，我国提出预防为主，防治结合的疾病防控策略，旨在改善养殖水体理化环境、增强养殖物种抗病能力、完善养殖育种管理监测，对推动我国水产养殖业健康、快速、可持续发展具有重要意义。鳗弧菌于1893年首次在欧洲曼鲡体内分离得到，属弧菌科革兰氏阴性菌，具有极生鞭毛，可兼性厌氧，为嗜盐菌。该菌于25?30deg;C生长迅速，可在富盐培养基中形成圆形乳酪色菌落。至2011年，己发现鳗弧菌中共有23种血清型(01-023),但是仅01、02障，在长期进化过程中形成一套完善的免疫防御体系用于抵抗外源微生物入侵，构成硬骨鱼类點膜相关淋巴组织(Mucosa-associated lymphoid tissue, MALT) 。硬骨鱼类皮肤结构包括黏液层、上皮层、基底膜、真皮层、真皮下层以及皮下肌肉层(图1.3)。上皮层未角质化，由5~10层活细胞组成，多数细胞为麟状上皮细胞，中间分布有其他细胞类型[16]。黏液细胞又称杯状细胞，是一种重要的上皮层细胞，外源物质入侵可促使點液细胞分泌大量點液。點液中含有可中和外源物质的免疫球蛋白、酶类、裂解物等。因此，黏液细胞在皮肤中的分布密度常作为评价鱼类天然屏障防御能力的指标[2]。此外，黏液细胞数量与生存压力有关，因此亦可作为鱼类健康状况的指标之一[17]。鳗麵、泥鳅等鱼类皮肤中还存在棒状细胞，可分泌警报组分，鱼体皮肤受损后警报组分分泌增加以提醒同类防御敌害。运动角膜细胞是上皮层中另一重要细胞组成，可在皮肤受损后数小时内由损伤边缘运动至损伤部位并覆盖于损伤处形成保护层[18]。Bullock等证实角膜细胞每分钟可运动5-12am[i9]。真皮层位于上皮层下方，由纵横交错的纤维结缔组织构成，含丰富的色素细胞并形成麟片。真皮下层由疏松结缔组织构成，分布有大量毛细血管及神经末梢，与皮下肌肉层相连。与哺乳动物相比，鱼类肠道不具有明显的前肠、后肠、盲肠结构。基于肠道上皮细胞及點液层的解剖形态，大多数鱼类肠道可分为三部分(图1.4A)[2a]。肠前部占肠道总长度60~75%，上皮细胞主要行使吸收营养功能。经证实，鲤科鱼类对蛋白物质的吸收场所位于肠道前端50%区域内(图1.4 8严]。肠中部占肠道总长度15?30%,肠域毛结构不规则，上皮细胞核中含液泡，细胞顶端胞饮作用活跃(图1.4 C)。Rombout等证实，鲤鱼肠中部是抗原摄取及加工的主要场所，可捕获固体相、液体相抗原物质[22]。肠后部占肠道总长度5~15%，上皮细胞主要行使渗透压调节功能[23]。Menke等在组织学水平详细描述了斑马鱼各脏器的形态特点，肠组织的空间分布形态见图1.5[24]。 第2章載膜损伤对議弧菌感染斑马鱼的影响 2.1引言 研究病原菌的致病机制可为疫苗开发提供理论依据，研究其感染的诱导条件则为疾病的预防策略提供依据。鱼类點膜组织肠道、皮肤、鲍因与外界环境直接接触成为病原进入宿主的主要途径，通常覆盖于點膜组织的點液层及上皮细胞等天然屏障可有效防止病原微生物入侵。虽然肠道、皮肤和鲍作为鳗弧菌感染机体的进入途径在多种经济鱼种上被证实，但在国内水产养殖中发现即使水体中伴有较髙密度的各类弧菌(包括鏡弧菌)，也不一定导致鱼体感染并大规模暴发弧菌病，而有时水体中只存在较低密度的弧菌也会导致弧菌病的发生。随着国内水产养殖集约化模式兴起，规模扩大、密度增加等养殖方式带来诸多问题，鱼体皮肤點膜层损伤、寄生虫感染和肠炎等时有发生。本研究通过建立斑马鱼皮肤损伤和肠炎模型，考察鱼体點膜受损时鳗弧菌的感染情况，探索續弧菌作为条件致病菌发病的主要原因。 2.2额材料 2.2.1菌株及实验动物 本章实验菌株鳗弧菌毒株MVM425分离自中国黄海海域感染弧菌病病鱼鱼体，由本实验室菌种库保藏。GFP标记的鳗弧菌MVM425菌株(MVM425-g射由本实验室构建，其在宿主体内能稳定表达GFP蛋白。本章实验动物斑马鱼购于上海嘉定某养殖场，体长3 土 0.5 cm,体重0.25 土 0.05 g。斑马鱼幼鱼由本实验室孵化，实验选用孵化4~5 d的斑马鱼幼鱼。本章使用的TCBS培养基购自上海盛思生化科技有限公司，