第四章 海洋动物细胞培养仪器设备的 清洗和消毒.ppt

一、细胞培养的要求 1、消毒 细胞培养的最大危险时发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起， 常见原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液的消毒不合格或不彻底等等。 消毒方法分类 物理灭菌法（紫外线、湿热、干热、过滤等） 化学灭菌法（化学消毒剂、抗生素） a、紫外线消毒 用于空气、操作台表面和不能用其他方法进行消毒的培养器皿 紫外线的杀菌波长范围为240—280nm，265~266nm的作用最强。 其主要是使DNA上相邻的嘧啶通过共价键结合形成二聚体，影响DNA的正常碱基配对。 紫外线的穿透力很弱，其杀菌只限于表面的照射。 b、湿热消毒 高压蒸汽消毒，使用最广泛、效果最好的消毒方法。 橡胶制品、玻璃器皿、金属器械。 湿热法  杀菌机制：在水分子存在情况下更易于使菌体蛋白凝固，热力穿透性更强。 1、巴氏消毒法（pasteurization） 61.1-62.8℃ 30min；71.7℃ 15-30s。 2、高压蒸气灭菌法（autoclaving） 121.3 ℃ 15-20min 可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。 3、煮沸法：100℃ 5min杀死细菌繁殖体。 c、过滤除菌 不能采用高压消毒的方法进行灭菌处理，如血清、培养液等 d、化学消毒法 75%酒精主要用于操作者的皮肤、台面及无菌室内的壁面处理。 1%新洁尔灭主要用于器械的浸泡 化学消毒灭菌法 根据作用机制不同，主要有以下几类： 1. 使菌体蛋白质变性或凝固 to denature proteins of bacterial cell 酚类---石碳酸、来苏、洗必泰等。 醇类--- 70%~75%乙醇杀菌力最强。 重金属盐类---红汞等。 烷化剂---甲醛等，杀菌力强，但毒性大，有致癌性。 2. 干扰细菌的酶系统和代谢 to interfere enzymatic system and metabolism of bacterium 氧化剂---过氧化氢、高锰酸钾等，与细菌的酶结合使之失去活性。 过氧乙酸 对细菌繁殖体和芽胞、真菌、病毒都有杀灭作用。 3. 损伤菌细胞膜  to damage cell membrane of bacterium 表面活性剂：新洁尔灭等增加菌细胞表面张力，并增加其通透性使细菌破裂。 化学消毒剂: 碘伏等大多对人体组织有害，只能外用或环境消毒。 e、抗生素灭菌 用于培养用液或预防培养物污染。 常用抗生素为青霉素及链霉素。 f、电离辐射灭菌 用Co60产生的射线照射48-72h 用高能电子束照射。 消毒方法的选择 实验室环境的消毒 培养器械的消毒 培养用液体的消毒 2、实验前的准备 根据要求准备好瓶管盘架、器械消毒盒等 准备器材数要大于实际使用数，瓶盖数大于瓶数、 将所需物品一并放入超净台内。 3、无菌室和操作台消毒 无菌室每周用过氧乙酸加紫外线消毒1-2次 超净台常用酒精擦拭 实验前无菌室及超净台紫外消毒。 4、无菌操作要求 （1）手指不能触及器材使用端。 （2）减少手与器材的接触面积，学会手指操作。 （3）一切操作，如打开或封闭瓶口、安装吸管、注射器等，都要在火焰前方进行，使用端用前要经过火焰消毒。  4、无菌操作要求 （4）瓶口要顺风斜放在支架上。试剂使用后应立即封闭瓶口，若长时间敞口，会增加落菌的机会。 （5）细胞培养各种用液要专管专用，并要勤换洗管，防止扩大污染和交叉污染。  4、无菌操作要求 （6）瓶口液滴不能再倒回瓶内，要用于酒精棉球擦拭，瓶口要再经火焰消毒。 （7）操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。 4、无菌操作要求 （8）工作台面上的用品要放置有序，布局合理，一般来讲，酒精灯要放在当中，右手使用的物品在右侧，左手使用的物品在左侧。  注意事项 1、双手 2、避免烫伤细胞 3、讲话，咳嗽 4、人员走动 5、培养用品的清洗 玻璃器皿 基本程序：浸泡，刷洗，浸酸，冲洗4个步骤。 洗液的配制 （1）根据具体情况，选择大小适宜的耐酸器皿，加入一定量的去离子水。 （2）按照比例，将重铬酸钾荣于去离子水中，为了充分溶解，边加边用玻璃棒搅拌。 （3）溶解完全后，将浓硫酸缓慢加入溶液中。 （4）洗液降到常温后，既可用来清洗器皿 5、培养用品的清洗 玻璃器皿 （1）、浸泡 新买的玻璃器皿自来水初步洗刷，5%稀盐酸浸泡过夜。 使用后的立即进入清水中，避免器皿内蛋白质干涸后粘附于玻璃上。 浸泡是要将器皿完全进入水中，无气泡空隙 5、培养用品的清洗 玻璃器皿 （2）、涮洗 防止损坏器皿表面光洁度，选择软毛刷，但不能留死角。 涮洗后要将洗涤剂冲净，晾干。 5、培养用品