农杆菌介导甜高粱Bar基因再生体系建立及水稻EIS基因转化概述.docVIP

　　农杆菌介导甜高粱Bar基因再生体系建立及水稻EIS基因转化概述 第一章 引言 1 甜高粱研究概况 甜高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)属禾本科(Poaceae)高粱族(Andropogoneae)高粱属(Sorghum)，也称糖高粱，是普通高粱的一个变种。甜高粱属 C4 植物，具有光合效率高、生物产量高、抗旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱和适应性广等特性，被誉为植物中的骆驼，在热带、亚热带和温带均可种植，主要种植在热带干旱、半干旱地区、高海拔低温山区及盐碱地区和土壤贫瘠地等地区（黎大爵，1992；杨文华等，2004）。甜高粱是一种多用途杂粮作物，其籽粒可以食用和酿酒；茎秆汁液丰富、含糖量高，可用于加工生产糖和糖浆，还可用作青贮饲料或加工成糖化秸秆饲料，最重要的是可以用来生产乙醇，代替石油等化石燃料，缓解全球能源危机（王艳秋等，2004；张志鹏等，2005；严晋跃等，2009）。尤其是近年来，随着国家禁止以玉米、小麦等粮食能源作物的乙醇生产，以甘蔗、甜菜等非粮能源作物的乙醇生产发展迅速。而在众多的非粮能源作物中，甜高粱具有种质资源丰富、抗逆性强、适应性广、生物产量高、茎秆含糖量高、乙醇转化效率高，乙醇生产成本低等优点，被认为是最具发展潜力的能源作物（曹文伯，2002；高士杰，2005；卢庆善，2008）。高粱被认为是植物组织培养困难的植物之一，经过几十年的发展，虽然取得了很大的进步，但仍落后于水稻、小麦、玉米等单子叶作物。甜高粱的组织培养研究起步晚，研究的也少，相关研究报道也很少。 . 2 水稻研究概况 水稻是世界上最重要粮食作物之一，在全球温带、热带、亚热带和寒带都可种植，在全球的种植面积超过 16346 万公顷，产量超过 1772 万吨，占全球作物总产量的 24.38%（FAO，2012）。水稻已经成为单子叶植物研究的模式植物，其遗传转化在品种改良、基因功能检测和突变体筛选中的作用日益凸显。随着大规模的水稻基因组测序的结束和水稻序列图谱的绘制，基因组数据库中积累了大量的数据，功能基因组的研究已经被提上议事日程。因此，如何建立一套稳定、高效的转化系统就显得非常重要。经过科学家们半个多世纪的不断努力，水稻的高效遗传转化系统已经建立，农杆菌介导的遗传转化技术也日益成熟。水稻的组织培养始于 1955 年 Fujiin，倒掉共培养培养液 I，加入制备好的农杆菌悬液浸染 15min，倒掉菌液，幼胚置于无菌滤纸上晾 25-30min，然后接种到铺有一层无菌滤纸的 MS 共培养培养基上，于 28℃黑暗共培养 2-3 天。愈伤组织则直接用 OD600 值 0.3-0.5 的农杆菌悬液浸染 20min，倒掉菌液，愈伤组织置于无菌滤纸上晾 35-40min，然后接种到相同的共培养培养基上，相同条件下共培养 2-3 天。共培养 2-3 天后，幼胚和愈伤组织转接到预筛选培养基上，在 28℃黑暗培养 5-7 天，再将其转接到含 500mg/L 头孢霉素和 20mg/L 潮霉素的筛选培养基上进行筛选。每 2-3周更换一次筛选培养基。经 4-5 周的筛选培养，幼胚转化获得的抗性愈伤先转接到继代培养基上继代 2-3 周，待抗性愈伤组织长到直径约 5 ㎜大小再转接到不含抗生素和筛选剂的分化培养基上进行分化培养；愈伤转化获得的抗性愈伤组织转接到含有 500mg/L 头孢霉素的分化培养基上进行分化培养，条件为 25plusmn;2℃每天 16/8h 光照/黑暗。 .. 第三章 结果与分析........20 1 甜高粱不同外植体愈伤诱导差异分析....20 1.1 不同处理对成熟种子愈伤诱导的影响......20 1.2 不同基因型和不同培养基对幼穗愈伤诱导的影响......22 1.3 不同基因型和不同取材时期对幼胚愈伤诱导的影响.......25 2 甜高粱不同外植体愈伤化差异分析........32 3 甜高粱再生苗生根、移栽与再生植株的获得.......38 4 甜高粱转 Bar 基因研究........43 4.1 潮霉素浓度筛选.......43 4.2 不同受体材料对高粱遗传转化的影响......44 4.3 不同基因型对高粱遗传转化的影响.....45 5 水稻成熟种子再生的影响因素......46 6 水稻再生苗的生根、移栽与再生植株获得......50 7 EIS 基因转化载体的构建与鉴定....51 8 农杆菌介导水稻转 EIS 基因研究.......54 9 水稻 T0 代转基因植株 PCR 检测.......56 第四章 讨论.....58 1 褐变对甜高粱植株再生的影响......58 2 外植体类型对甜高粱植株再生的影响....58 3 基因型对甜高粱植株再生的影响.......59 4 不同培养条件对水稻成熟种子