功能化第五代树型大分子包裹纳米金颗粒之制备及其在基因传递应用.docVIP

　　功能化第五代树型大分子包裹纳米金颗粒之制备及其在基因传递应用 第一章绪论 1.1基因治疗简介 随着全球环境的恶化，人口的增长，全球老龄化趋势的加剧，癌症已成为威胁人类健康和生命的主要杀手。据世界卫生组织推测，到2020年前，全球癌症发病率将增加50%，即每年将新增1500万癌症患者，同时癌症的死亡人数也在迅猛上升；2030年癌症患者的人数将增至1320万。在中国每分钟就有六人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每七到八人中就有一人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升。更值得注意的是在我国的上海，恶性肿瘤病人现患率已经超过1%，现患率绝对数在13万以上。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗，这些手段用于癌症的治疗不仅给患者带来了巨大的痛苦，而且治愈率非常低，生存5年以上的患者仅占全部恶性肿瘤患者的45%。因此，人类想摆脱癌症的困扰必须寻找新的癌症治疗方法。进入二十一世纪，随着人类基因组计划的完成，基因治疗为基因疾病的治愈带来了福音。癌症是人体细胞在外在环境因素的作用下，内在多种前癌基因被激活和抑癌基因失活的多阶段长期演变的结果。基因治疗作为从根源上治疗癌症的手段，近年来受到了人们的广泛关注，并成为了继手术、放疗和化疗后，发展的第四类癌症治疗方法[1，2]。基因治疗的原理是通过操作遗传物质来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的错乱，杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治病的目的[3]。相对与传统的手术、放疗和化疗方法，基因治疗的优点：肿瘤针对性强，治疗效果显著，不损伤正常细胞，减轻治疗痛苦。 1.2基于聚酷胺胺（PAMAM)的基因传递载体 聚酷胺-胺（PAMAM)树状大分子是一种福射状对称、高度分枝、类似球状的新型纳米化合物。1985年由美国化学家Tomalia等[34]人首次合成。自其问世以来，PAMAM直得到科学工的青睐，研究者们一直致力于其合成方法的改进以及其应用领域的拓展[35-41]。目前为止，PAMAM的合成方法主要有发散法和收敛法（见图1-2)。此外，关于PAMAM传递基因的内在机制也成为了当前研究的热点，包括PAMAM及功能化后的PAMAM的细胞内吞的效率、细胞内的传递途径、细胞内的定位等。Albertazzi等[74]研究发现PAMAM进入细胞的主要途径是网格蛋白通道和巨胞饮通道内吞，其细胞内定位特征类似于细胞穿膜肽TAT。虽然基于PAMAM的载体在基因传递领域具有潜在的应用价值，但是，也存在一些待研究的问题，比如：传递基因到目的细胞的具体途径及机制有待研究，转染基因进入目的细胞的障碍需要探讨。体内的降解速度以及在血液运输中是否会产生毒性有待临床检验，PAMAM新的改性有待探索。此外，目前PAMAM以及改性后的PAMAM传递外源治疗基因的种类单一，只用于传递pDNA、siRNA或ssDNA。因此，本课题试图寻找新的改造PAMAM的方法，以降低载体的细胞毒性并提高基因转染效率，同时实现一种载体可应用于多种外源性治疗基因(pDNA、siRNA和ssDNA)的传递。 第二章乙酷基修饰的第五代树状大分子包裹纳米金颗粒(acetylated Au DENPs)的制备及其在基因传递中的应用 2.1引言 研究表明，第五代树状大分子有较高的基因转染效率，但是细胞毒性相对较高限制了其在体内基因传递方面的应用。许多研究者致力于通过表面修饰来改性第五代树状大分子以提高其在基因传递应用中应用的价值，也取得了一定的成果[86, 87]。本课题组采用树状大分子包裹纳米金颗粒的方法来降低树状大分子的毒性，提高其基因传递的效率，实验结果表明：氣金酸与树状大分子比为25时，第五代树状大分子的基因传递效率有了很大的提高，毒性也有一定程度的降低[53]0为了探索以上两种改造第五代树状大分子性能的方法是否可以有机的结合起来，共同应用于提高第五代树状大分子在基因传递方面的性能。本章节致力于合成氯金酸与树状大分子比为25时，乙醜化修饰的第五代树状大分子包裹纳米金颗粒在基因传递中的应用。本章研究主要是基于末端为氨基的第5代PAMAM(G5.NH2)，在其表面修饰不同数目的乙酰基（0个，5个，10个，20个，30个），然后以原位还原的方法，通过控制树状大分子与氯金酸的摩尔比（1:25)合成包金量为25的不同程度乙酰基修饰的Au DENPs来进行基因传递的研究。我们釆用H0, HI, H2, H3和H4分别代表表面结合乙酰基为0个、5个、10个、20个和30个的Au DENPs。核磁分析、紫外吸收值的测定被用于检测是否成功地合成了纳米尺寸的不同程度乙酰基修饰的Au DENPs。Au DENPs-Ac/质粒DNA复合物的性质，包括载体对质粒DNA的结合能力，复合物的粒径大小和表面