山羊小肠上皮细胞冻存与复苏的试验研究.pdfVIP

Heilongjiang Animal Science 30 and Veterinary Medicine № 3 2008 羊小肠 细胞冻存与复苏蛔试验研巍 王海霞，匡 伟，赵国琦 (扬州大学动物科技学院，江苏扬州225009) 中图分类号：$826．8 9 文献标识码：B 文章编号：1004—7034(2008)03—0030—02 在体外细胞培养工作中，为了保种和长期保存其 别采用3种不同的方法进行冻存。第1种：先置普通 生物活性，细胞的冷冻与复苏成了一个重要的环节。 冰箱 (4 cc)30 mjn一低温冰箱 (一20℃) 对于体外培养的细胞，必须能够以一种较高的效率实 120 min一超低温冰箱(一80 cc)120 min一液氮罐 现冻存与复苏，才能达到组织工程种子细胞的要求。 口120 min，而后置液氮中。第Ⅱ种：先置普通冰箱 试验采用不同的冻存液、不同的冻存速率对体外分离 (4 cc)5 h一液氮面6—10 cm处1 h一直接浸入液 培养的山羊IEC进行冻存与复苏，旨在提出最佳的冻 氮中。第Ⅲ种：将冻存管用棉花包裹置于超低温冰箱 存复苏方案。 (一80 cc)过夜，翌日浸入液氮。冻存30 d后，接种 1 材料与方法 于24孔细胞培养板，每组4孔，每孔1 mL，5％CO：培 1．1 试验材料 养箱37 cc培养。培养12 h，将贴壁细胞消化后用台 1．1．1 仪器设备 超低温冰箱(一80 cc)、液氮罐、 盼蓝染色，计算平均细胞贴壁率。 恒温水浴锅、进口冻存管(规格为2 mL)。 1．4 复苏步骤 1．1．2 细胞培养液 DMEM培养基，添加10％的胎 (1)将冻存管从液氮中移至一80 cc放置1—2 h， 牛血清、5 g／mL胰岛素、10 ng／mL EGF、100 IU／mL 防止冻存管中冷空气迅速膨胀而爆炸。 青霉素、100 g／mL链霉素。 (2)将冻存管放置在60 cc热水中解冻，出现冰 1．1．3 冻存液 二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司 水混合物时，此时温度为0 oC，立即将冻存管放人冰 产品；胎牛血清(FBS)为杭州四季青产品；葡聚糖 中(0—4 oC)，转移至超净台。 (Dextran MW=50 000—70 000 D)为Nakalai tesque (3)取事先加有9 mL无血清DMEM的离心管1 产品。冻存液I的配制：10 g葡聚糖溶于50 mL DM— 只，迅速将冻存管中1 mL冻存液加入其中。 SO中配成DX／DMSO混合液，121 cc灭菌20 min，常 (4)4 cc、1 000 r／min离心7 min，无血清DMEM 温保存，FBS：DX／DMSO溶液=9：1；冻存液Ⅱ的配 洗3次，计数后加到生长培养基上培养，种植到培养 制：FBS：DMSO：9：1；冻存液Ⅲ的配制：DMEM： 瓶中。 FBS：DMSO：7：2：1。 1．5 台盼蓝染色鉴定细胞活力 1．1．4 待冻存细胞 为山羊小肠上皮细胞。 0．4％台盼蓝100 L，滴加900 L复苏12 h，与 1．2 不同冻存液对山羊小肠上皮细胞冻存效果的比 重新消化下来的IEC细胞悬液混匀后取10 L于细 较 胞计数板上计数，根据公式计算复苏的IEC贴壁率。 将欲冷冻保存的细胞调整到良好生长状态，使其 2 结果 处