大豆开花基因GmGAL1之克隆及表达研究及水稻干旱表达基因启动子之克隆和研究.docVIP

　　大豆开花基因GmGAL1之克隆及表达研究及水稻干旱表达基因启动子之克隆和研究 第一章大豆开花基因GmGALl的克隆和表达分析 1.前言 开花是高等植物由营养生长向生殖生长转变的一个重要的生理过程，正确的开花时间是生殖发育的重要前提保障。正因为如此，植物已经进化出复杂的、精心调控的机制来保证植物在最佳时间开花。经过对拟南芥几十年的研究，已发现植物开花控制途径共有四条：环境因子作用的光周期途径（Photoperiodic pathouspathpson and Dean, 2002; Sung and Amasino, 2004)。这四条途径交叉互作，形成复杂的分子网络。 1.1.1光周期途径 拟南芥在长日条件下的幵花时间要比短日条件下早的多。这种现象表明拟南芥中有一些基因参与了光信号的识别。拟南芥中的光受体主要有五种光敏色素(PflYA to PHYE )和两种隐花色素CRY2)组成(Thomas and Vince-Pme，1997)。研究表明P//Ky能够识别红光和远红光(Briggs et al, 2001; Quail et al, 1994)； 和识别蓝光和UV-A(Ahmad and Cashmore, 1993; Briggs et al, 2001; Lin et al, 1998)。只有p//yA、和C7?r2开始接受光信号，光周期途径信号才能进入昼夜节律循环过程。当夜长达到一个决定性的长度，下游基因才能被激活(Levy and Dean, 1998)。位于光受体下游的基因，GI (GIGANTEA)和09 (CONSTANS)是研究相对详尽的两个基因。如果这两个基因发生突变，那么在长日条件下会出现晚花，而在短日条件下对幵花的影响甚小。CO可能是尸//K?和的最重要的靴基因(Putterilletal，1995)，在光周期过程中被精确调控。研究表明CO mRNA的昼夜节律对通过光周期途径调节的开花过程至关重要(Valverde et al, 2004)，然而通过CO的幵花激活过程确实是一个剂量依赖的过程(Putterilletal，1995)。另一方面，G/编码含有六个跨膜结构域的定位于膜上的蛋白，其表达同样受昼夜节律调节。也就是G7对维持接夜节律具有重要作用。另外两个生物钟基因ZJ/r和CCAi在g冲表达量很低(Foasino, 1999)。通过组织特异性启动子启动fXC的表达证实如果完全抑制幵花，需要FLC在叶和莲顶端分生组织中都表达(Searle et al,2006)春花作用能够使FLC mRNA的丰度降低，然而由于其它一些FLC不依赖的春化途径能够调节AGL24和AGZJ9，所以FLC基因不是春化反应的必要条件(Michaels et al, 2003; Schonrock et al, 2006)。FRI是FZr基因的正调控因子，其螺旋-螺旋结构域可能就是起调节作用的组成部分。的突变对于显性的F等位基因起上位作用，FZC在FRI缺失突变体中过表达表现出晚花表型(Michaels et al., 1999) 1.1.3自主途径 植物经过外界环境因素和内部自身发育机制的调节，自会幵花，称为自主途径。LD, FVE，FY和FCA基因的突变会使植物在长日和短日条件下均晚花，因而它们是位于自主途径的基因。LD基因编码953个氨基酸，其中含有两个双向的核定位基序，其蛋白含有谷氨酸富集结构域，与其它物种中的特定转录因子是直向同源序列。基因也可能参与了光质的识别，因其突变体对光中高频红光和远红光不敏感(Leeetal，1994)。FCA蛋白包括两个RNA识别基序和一个acknightetal，1997)。通过选择性剪切来调节自身表达，能够产生a，|3，丫和S四种变体，但是只有yhiRNA编码有功能的FCA蛋白，且只有组成型表达的丫 mRNA才能导致转基因植物早花，这也能说明ymRNA的重要性(Macknight et al, 2002)。FVE是一个推测retinoblastoma相关蛋白，是组蛋白去乙酰化蛋白复合体中的一部分，能抑制FLC的表达。此外/T，FPA也能抑制FLC基因，通过这些来保证植物从营养生长向幵花转变(Schomburg et al, 2001; Yushibumi,2004)。 2.材料 2.1植物材料及取材 GmGALl基因的克隆，是根据同源克隆思维，参考拟南芥光周期主要基因的mRNA序列，利用GENBANK、TAIR等网上资源，通过EST查询得到大豆中这些基因的一段序列，以此段序列为基础通过3#39;,5#39; RACE方法扩出其余序列部分，方法见Invitrogen和TAKARA的3#39;, 5#39;RACE试剂盒（许娇丼博士完成）。考虑一些基因受光周期和生物钟调控，以上周期性