棉花种子特异性启动子的克隆、载体构建及△9Elo基因的转化研究.docVIP

　　棉花种子特异性启动子的克隆、载体构建及△9Elo基因的转化研究 1 前言 1.1植物启动子的简介 植物在其生长和发育的过程中，基因的表达受各种理化的因素调节控制，根据自身的需求和环境的改变做出相应的反应，定时、定量以及定位地表达所需的基因产物。在基因表达的过程中，涉及到各个层次的精细的调控，包括 DNA 水平、转录层面、转录后过程、翻译水平、翻译后加工、运输过程和定位等。其中，转录水平调控是基因表达调控的关键部分，尤其是转录起始水平的调控对基因表达是极其重要的。启动子是驱动基因转录必不可少的调控元件，发挥着重要的作用（王瑞琲，2008）。因此，研究植物的启动子，有利于更好地分析基因的表达，对进一步研究植物的生长发育有着重要意义。启动子（Promoter）是基因转录表达的开关，是一段位于功能基因 5端上游的 DNA序列，其含有特定的保守基序，其长度因生物种类而异。在启动子区有多种顺式作用元件，识别 RNA 聚合酶，指导全酶与模板的正确结合，形成转录起始复合体，决定转录的方向和效率以及所使用的 RNA 聚合酶的类型，精确而有效的启动功能基因的表达。真核细胞中 RNA 聚合酶有三类，即 RNA 聚合酶 I、II、III，根据 RNA 聚合酶的不同种类，真核生物启动子可以分为三种：I 型启动子（rRNA 基因启动子）、II 型启动子（mRNA 基因启动子）、III 型启动子（tRNA 基因启动子），高等植物启动子属于 mRNA基因启动子，即 II 型启动子，由 RNA 聚合酶 II 识别，控制众多编码蛋白质基因的表达（王莹等，2007）。高等植物 II 型启动子区基本上可以分为两部分：一部分是核心启动区，包括转录起始点附近的起始子及邻近的 TATA 框，它是形成普遍性转录结构所需要的，决定转录起始点和转录频率；另一部分是上游调控区，是位于 TATA 框上游的保守序列，它决定基因转录的特异性和活性。这两部分都参与基因转录的调控，但后一部分起主要的控制作用（胡廷章等，2007）。启动子在不同的植物中其种类和数量都有差异，但是他们有着相对保守的序列和元件，如转录起始位点、TATA-box、CAAT-box、GC-box 等，这些元件对基因的转录表达及基因表达的时空特性是不可或缺的（Datta et al., 1998）。 . 1.2植物启动子的分类 植物基因启动子按其特点和作用方式的不同大体可以分为三种：组成型启动子、诱导型启动子以及组织特异性启动子。除此之外，还有两类较为特殊的启动子，双向启动子和可变启动子。由于划分界限不是绝对的，一种启动子可能在特征上会与其它启动子发生交叉。组成型启动子（constitutive promoter）能够调控目的基因在时空上无差异的持续稳定表达的启动子。它的特点是：启动的起始频率和启动效率不会受到时空及外界因素的影响；功能基因的表达量是一定的，并且表达具有连续性；蛋白和 RNA 的表达量恒定；功能基因在任何组织部位和任何发育时期都会表达（Sanders et al., 1987）。植物基因工程中被广泛使用的组成型启动子主要来自于根瘤农杆菌、病毒和植物中，例如：于花椰菜花叶病毒的 MV35S 启动子是双子叶植物转基因中应用非常广泛的启动子；水稻肌动蛋白 Actin I 启动子和玉米泛素 Ubiquitin 启动子是单子叶植物转基因工程中常用的启动子；来自于细菌的 NOS 启动子和 Ocs 启动子，在植物基因工程中也经常应用。CaMV 35S 启动子来自花椰菜花叶病毒（cassava virus mosaic virus），在植物转基因工程中，被广泛的使用在对双子叶植物的研究中。由于该启动子驱动花椰菜花叶病毒基因组所生成的转录产物沉降系数为 35S，故将这种驱动花椰菜花叶病毒基因组表达的启动子称为 CaMV35S 启动子，简称 35S 启动子。在植物转基因工程中，35S 整合到植物基因组中可以在植物不同的生长时期和大部分器官内启动下游基因高效表达（Sanders etal., 1987）。 .. 2 材料与方法 2.1 试验材料 2.1.1 植物材料 启动子克隆材料：海岛棉（Gossypium barbadense）新海 40，由新疆德佳种业公司提供。受体材料：陆地棉（Gossypium hirsutum）邯无 198，由邯郸市农业科学院、河北农业大学提供；拟南芥（Arabidopsis thaliana）为野生型。 . 2.1.2 载体及试剂 克隆载体PMD18-T购于TAKARA公司，中间载体PAUX载体、表达载体pCamBAR载体为山东农业大学生科院实验室馈赠，表达载体 pBI121 为山东农业大学农学院棉花分子育种实验室保存，含球等鞭金藻（Isochrysis galbana）Delta;9Elo