甜高梁蔗糖转运蛋白SUT1基因克隆及转化研究.docVIP

　　甜高梁蔗糖转运蛋白SUT1基因克隆及转化研究 第一章 前 言 1.1甜高粱简介 甜高粱又称为糖高粱，是粒用高粱 [Sorghum bicolor( L). Moench]的一个变种，不同之处是甜高粱较高粱苗期分蘖力强，叶脉有腊质，其茎髓部富含甜的生汁，其籽粒较小，再生能力强。1851 年法国从中国引进甜高粱，1854 年美国从中国上海引进并称为糖米[1]，因非洲严酷的地理和生态环境，让甜高粱具有非常强的耐逆性，使其在温带、热带和亚热带等地均可种植，地理分布广泛[2]，在全球大部分可居住的干旱、半干旱、酸碱地、低洼易涝及高海拔低温山区都可生长，因此被称作作物中的骆驼；同时又因其生育周期短、含糖量高、糖分积累快及乙醇转化率高等优点，被认为是最具有开发潜力的能源作物之一[3]。甜高粱是高能作物，每亩甜高粱在 1 天内合成的碳水化合物可以用于生产 3.2 L 酒精，其效率是玉米的 3.2 倍（1.0 L），是小麦的 16 倍（0.2 L）。甜高粱属于C4植物，其生物产量高，具有高的光合速率[4]，其每亩地能产150～500Kg的粮食，但其精华是其富含糖分的茎秆，其茎秆产量可达每亩5000～10000Kg。其籽粒可以食用和饲用；茎秆可用于制取乙醇，M. Elangovan等[5]报道其生产一公升乙醇的成本要比甘蔗的成本低。长期以来，在亚洲、非洲和美洲的高温少雨地区，高粱作为一种多用途作物而被广泛种植，以提供粮食、饲料、燃料、酿酒原料以及工业用淀粉[6]。此外，甜高粱的耐逆性强，适应性广，具有抗旱、耐涝、耐盐碱、耐瘠薄、耐高温和耐干热风等特点[7]，又因其可在高温、低洼和盐碱等边际性土地上进行种植。所以，将甜高粱茎秆作为生产燃料乙醇的原料，将不会与人争粮和与粮争地。因此，甜高粱的生产受到广泛的重视，近年来发展较快。 .. 1.2甜高粱组织培养的研究进展 甜高粱的研究目前主要集中在育种和茎秆生产乙醇工艺研究两个领域。美国在甜高梁新品种选育上的起步较早，1965 年开始先后选育出凯勒(Keller)、雷伊(-81E、洛马(Roma)等品种，但这些均为常规种。国际半干旱热带作物研究所（ICRISAT）的甜高粱研究工作开始于上世纪 80 年代，但是由于应用面积较小等原因，于 90 年代中断，直到近几年才恢复[8]。我国甜高粱育种起步于上世纪 80 年代，近年来，随着人们对甜高粱多种加工用途认识的进一步加深，甜高粱育种工作已成为我国高粱研究工的工作重点之一，并已取得了一定的进展。甜高粱是被公认的较难建立再生体系的一种作物[12,13]，大量研究结果表明，高粱愈伤组织的诱导和再生，是诸多因素影响的结果，不同的品种[14-16]、不同的外植体、不同的培养基成分、不同的外源激素的配比等都是影响高粱组织培养成功与否的关键因素[17]。用幼穗诱导的愈伤组织胚性良好，几乎都可以获得再生苗，分化率较高，有的可以达到 100%。但获取幼胚和幼穗费时、费力，同时受季节、地域的限制，很难保证充足而稳定的外植体供应。而于成熟种子的外植体，如成熟种子、成熟胚、芽顶端分生组织等可以保证外植体的稳定供给[27]，其中成熟胚的诱愈率为 59%～100%，分化再生率为 25%，与其它外植体相比，以成熟胚上切下的芽端为外植体进行研究，取材容易，不受时间限制，但有一定的局限性，即分化率相对较低、消毒困难。近年来，高粱组织培养研究工作取得了长足的发展，Kishore 等通过丛生芽途径得到了高粱再生植株[28]。俆丹等[29]以甜高粱成熟种子为外植体得到了再生植株，愈伤组织诱导率为 77.26%，但是周期较长。 第二章 甜高粱离体再生体系的建立 2.1 材料与方法 本研究使用的培养基为 MS 培养基（配方见附录 1），配制好的母液至于棕色瓶中，4℃保存备用。愈伤组织诱导培养基、愈伤组织分化培养基及再生培养基都是以 MS 培养基为基本培养基，在此基础上添加所需的不同生长激素及其他附加物而形成的。将配制好的培养基 PH 调至 5.8-6.0，高压蒸汽灭菌，121℃ 灭菌 20 min。等培养基温度降至 60℃左右时，将不能用高压灭菌锅灭菌的激素按比例加入到培养基中，然后将培养基分装到组培瓶中，等培养基表面水分散发，培养基完全凝结后使用。以甜高粱品种 M-81E 的种子为外植体。接种时所需的镊子（用报纸包好）、滤纸（用剪刀将滤纸剪成培养血大小装于培养血中）、蒸馏水（蒸馏水分装于组培瓶中）等于灭菌锅中 121℃ 灭菌 25 min。将超净工作台用紫外预先灭菌 30 min 以上，在超净工作台中将甜高粱种子用 75%的乙醇灭菌 1～2 min，其间不时晃动；然后用 0.1%的升汞灭菌 10～15min，其间不时晃动一下；然后倒掉升汞用无菌水洗涤 4～5 次；再用无菌的滤纸吸干水。将灭菌后的种子