长效人血清白蛋白制备及生物性能与药代动力学分析.docVIP

　　长效人血清白蛋白制备及生物性能与药代动力学分析 第一章前言 血容量不足常引起低血压、器官血流灌注不足，进而引起多器官功能障碍，乃至威胁生命[1]。外伤、外科手术失血、烧伤和全身炎症反应综合征（systemicin flammatory response syndrome, SIRS)引起的毛细管渗漏等均可引起低血容量症[2]，此时，进行合理的体液复苏以维持足够的组织灌流对于提高病人的生存率至关重要。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA)作为一线容量扩充剂，被广泛用作危重病人的短期血浆替代品，以有效扩充血容量。4.5%HSA溶液的血容量扩充作用是晶体复苏液的4倍[3]，在美国，约有26%的HSA用于治疗低血容量症[4]。然而，对于不同血容量扩充剂（包括胶体液和晶体液）的疗效和安全性一直存在争议尤其在涉及毛细管通透性增加的疾病治疗中，外源性输注的HSA容易穿过毛细血管内皮细胞间隙，渗透到组织间隙中，引起组织水肿甚至病情恶化HSA的临床应用存在一定局限性。另外，HSA适应症多、用量大，近年来，由于血菜日益紧缺等原因致使HSA供应十分紧张，一度出现了供不应求的局面。如何克服HSA血管保留率差及紧缺等难题是一个亟待解决的问题。 1 HSA的性质和结构 HSA是人血衆中含量最丰富的蛋白质，约占血楽总蛋白的55%-60%，渗透压占全部血装的80%[9]。HSA是一种含有585个氣基酸的单链无糖基化蛋白质，Mr为66.5kDa，等电点为4.7-4.9。HSA分子富含a-螺旋（?67%)，结构紧密，呈对称的椭圆形，长短轴分别为15 nm和3.8 nm_, HSA强有力的内部结构，使其比其他血菜蛋白更稳定。HSA是单条肽链盘曲形成的球状分子，富含门冬氨酸和谷氨酸，只含有一个色氨酸残基，含有35个半胱氨酸残基，形成17个二硫键，只有一个游离半胱氨酸（Cys34)位于蛋白表面[n]。HSA富含极性氨基酸，每个分子约含有180个可滴定基团，在血衆中，HSA具有18个净电荷，因此HSA在水溶液中具有高度可溶性。HSA含有三个结构相似的结构域（I、II和III)，每个结构域又包合两个亚结构域（a和b)，各结构域通过17个一硫键保持稳定（图1-1) [12]。 2 HSA的体内合成、分布和代谢 HSA基因长26 kb，定位于4号染色体的qll~22，含有14个内含子、15个外显子，其mRNA长2.1肝脏是HSA合成的主要场所，初级翻译产物为前白蛋白原（preproalbumin)，是白蛋白的前体，含有609个氨基酸残基，其中1-18为信号肽，19?24为原肽（propeptide), 25?609为成熟白蛋白。前白蛋白原在粗面内质网中切除信号肽，生成内蛋白原（proalbumin),然后在高尔基体经组织蛋白酶B切除原肽生成成熟白蛋白，从肝细胞分泌出来[i4]。健康青壮年体内，每天合成相当于血循环中HSA的10%,大约为12~25 go在正常生理条件下，机体同一时间只有20%~30%的肝细胞合成HSA，肝细胞不储存HSA，HSA的合成与机体的营养状态、激素和渗透压环境密切相关[15]。血架胶体渗透压和肝细胞周围的间质液体的渗透压是HSA生物合成的重要调节因素，当机体启动HSA合成时，其合成速率可增加到正常情况下的2~3倍[16]。HSA合成后通过两条途径进入血循环[I7]: 是直接透过细胞壁进入肝窦；二是进入细胞间隙和窦壁，通过肝淋巴系统进入胸导管，最后进入血循环。如图1-2所示，人体内的HSA约有40%分布在血管外，60%分布在血管外池；每小时约有5%穿过毛细血管内皮渗漏进入组织液，再经淋巴系统通过胸导管重新返回血循环，因此血管内外HSA每天可交换一次。 第二章人血清白蛋白的分离纯化及其聚乙二醇修饰产物的制备 HSA是含585个氨基酸残基的单链无糖基化的蛋白质，Mr为66.5 kDa[i3]。HSA分子中含有59个赖氨酸残基，末端为天冬氨酸残基[]，共有17对二硫键，只有一个游离巯基（Cys34)。HSA具有重要的生理功能，是维持血液胶体渗透压(COP)的主要成分和运输内源性及外源性物质的重要载体[1?5]。为了维持HSA的生理活性并获得均一的修饰产物，本实验分别以Cys34、TV-末端氨基为靴点，采用Mr为20 kDa的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG-MAL)和单甲氧基聚乙二醇丙酸(mPEG-ALD)为修饰剂，对HSA进行定点修饰，制备Cys34定点修饰产物（PEG-cys34HSA)和TV-末端定点修饰产物（TV-terminal PEG-HSA)。同时制备了Mr相当的随机修饰产物（random PEG-HSA)，以作为体内、外性质测定的对照品。 第一节人血白蛋白的分离纯化 利用SDS对HSA进行纯度检测，电泳结果显示在