绿色荧光蛋白发现及发展.docVIP

绿色荧光蛋白发现及发展文章编号：1005－6629(2009)01－0049－04中图分类号：G633.8文献标识码：B 生物发光是一个很普遍的生物学现象。早期的生物研究大多涉及分类、形成和生态方面，后来重点转移到生态、生化的研究，目前已进入分子生物学的研究水平。从不同生物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同。迄今，腔肠动物门多管水母属的维多利亚多管水母（aequorea victoria）的发光蛋白系统研究得较为深入。 多管水母体内存在着两种发光蛋白，即光蛋白――水母素（aequorin）和绿色荧光蛋白（GFP，green fluorescent protein）。光蛋白作为分子标记及Ca2+的生物学指示剂，已被成功地应用于哺乳动物、植物、酵母、大肠杆菌细胞，用于检测很多重要的生理学和病理学反应。GFP作为良好的细胞、发育、分子生物学的活体标记，用于监测各种体系中的基因表达、蛋白定位以及多种细胞活动。利用GFP进行示踪的研究范围相当广泛，从细胞生物学的基础研究如细胞骨架和细胞分化、细胞器动力学和囊泡跟踪，到一些热门的前沿和学科和技术领域，如器官移植、基因治疗、神经生物学等等。 日本科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖。他们的工作不但在科学上对化学、生物学、医学等领域具有重要的意义，而且也与人们的日常生活密切相关，对于提高人类的生活品质以及进一步改善人类的健康有十分重要的意义。 1研究GFP的时间线索 GFP从最初被发现到今天广为应用，经历了半个多世纪的时间。首先简单回顾一下这半个多世纪内和GFP相关的主要事件。 1955年人们首次注意到水母体内的绿色荧光物质。 1962年下村修从维多利亚多管水母中提取并分离了GFP，证实了绿色荧光物质是一种蛋白质。它的溶液在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。 1969年之前称为绿色蛋白质（green protein）得名“绿色荧光蛋白”。 1974年研究发现光蛋白和GFP两种分子之间会发生能量转移（图2）。 1979年下村修找到了GFP中的生色基团（Chromophore）（图3，图5）。 1985年普腊石（Douglas Prasher）根据蛋白质的氨基酸顺序拿到了光蛋白（水母素）的基因。 1992年普腊石拿到了GFP的基因。 1993年GFP中生色基团的结构被确认。 1994年沙尔菲通过大肠杆菌和线虫研究获得了GFP的生色机理；是年，第一种蓝色荧光蛋白被报道，并提到了它可用于荧光共振能量转移（FRET）实验中。 1995年研制出了增强型绿色荧光蛋白（EGFP），它的转录速度比野生GFP快四倍。 1996年得到了野生GFP和EGFP的晶体结构，钱永健在EGFP的基础上，利用突变技术，设计并研制出黄色荧光蛋白。 1997年光蛋白和GFP被用于Ca2+的敏感指示剂。 1999年后各种各样的荧光蛋白被发明、改造并用于科学研究。 在研究GFP的50多年间，2008年诺贝尔化学奖的三位得主做出了至关重要的贡献。 2下村修与维多利亚水母 在下村修以前就有人研究过生物发光现象，例如萤火虫发出荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化氧化底物分子荧光素（luciferin）以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修的研究。 1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了维多利亚多管水母中的发光蛋白―水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班前，他将产物倒进水池里。临出门前关灯，回望了一眼水池，见到水池闪闪发光。因为水池也排放有养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响了光蛋白。然而不久之后，他便确定钙离子能增强光蛋白发光。 1963年，他和另一位研究者约翰森在《科学》杂志报道钙和光蛋白发光的关系。其后Ridgway和Ashley提出可以用光蛋白来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，光蛋白成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。 其实早在1955年，Davenport和Nicol就发现水母可以发出绿光，但不知其因。在1962年下村修和约翰森在那篇纯化光蛋白的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，通过纯化他们得到了这种蛋白，当时称之为绿色蛋