体细胞核移植.ppt

动物克隆--体细胞核移植 体细胞核移植步骤 体细胞核移植步骤 供体细胞的选择 受体细胞的准备和去核 体细胞核移植 重构胚激活 重构胚培养与移植 供体细胞的选择 供体细胞的选择和处理在整个核移植体系中有着非常重大的意义，它不但影响重构胚的倍性、核的重编程、重构胚的发育，还决定着核移植胚胎发育的方向和命运。 供体细胞的选择 哺乳动物的各种体细胞核中都含有该物种特有的全套遗传信息。 理论上说，各种类型的细胞经过核移植都能重获发育全能性，但事实并非如此。 从现有的研究来看，不同类型的体细胞经过核移植后，去分化和重编程的能力可能有一定得差异。 供体细胞的选择 到目前为止，还没有用神经细胞、原始生殖细胞进行核移植得到过克隆动物。 而来源于生殖系统的细胞、胎儿成纤维细胞和终末分化的B或T淋巴细胞都可以作为供体细胞，尤其是以卵丘细胞和颗粒细胞为核供体所得到的核移植动物最多，这可能与其分化程度较低有关 供体细胞的选择 供体细胞所处的细胞周期阶段对核移植效率有明显的影响。 因为供体细胞核与受体胞质融合后，核质相互作用等过程是否协调是克隆胚胎发育至分娩的关键因素 供体细胞的选择 有研究表明，G0期细胞状态与受体细胞状态很相似，使得供体细胞与受体细胞的细胞周期基本同步。 现有的研究显示，除了S期细胞外，用G1期、G2期和M期细胞作为供体，都已经得到了核移植动物。 供体细胞的选择 Miyamoto（2007）等的研究中发现同步化于G1期的供体细胞，比G0期细胞更有利于重构胚的发育，且对重构胚的发育非常有利。 具体哪种状态的细胞更有利于核移植效率的提高还有待于进一步深入研究 受体细胞的准备和去核 用于核移植的受体细胞大体有三种，包括去除原核的合子、2-细胞期胚胎卵裂球和成熟卵母细胞。 其中使用去核的MII期卵母细胞做受体是哺乳动物体细胞核移植中使用最多的。 为什么选择MII期卵母细胞？ 选择MII期卵母细胞做受体是因为其胞质中存在一类重要的蛋白因子，即成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF） 成熟的MII期卵母细胞维持着高水平的MPF活性，在受精或被刺激后，MPF活性下降，细胞完成第二次减数分裂而MII期卵母细胞在没有适当刺激下，细胞周期处于停滞状态，便于进行体外操作。 其次MII期卵母细胞的胞质环境相对于合子，居于更强的接纳供体细胞的能力。 受体细胞的准备和去核 受体细胞的去核是能否成功完成核移植的一个限制因素，也是影响核移植效率的另一重要环节。 卵母细胞的去核方法概括起来有以下几种： 盲吸法（常用） DNA染色示踪去核法（常用） 末期去核法 化学诱导去核法 功能性去核 蔗糖处理示核法 化学去核法 显微镜显示法去核 高速离心去核法 裸卵法或半卵法等 体细胞核移植 将供体细胞移植入受体细胞的方法主要有两种： 带下注射 胞质内注射 带下注射 带下注射 是将供体细胞注射到卵周隙中，通过细胞融合使供体细胞核进入受体胞质中，这一方法注入供体细胞后必须保证细胞膜的完整性，才能使随后的融合成功。 注核后有个融合的步骤，研究者们也发明了各种融合方法，并不断的进行改进和完善。 根据细胞融合方法的不同，又可以分为以下几种：化学融合，电融合 胞质内注射 胞质内注射是将供体细胞核或者供体细胞直接注射到卵母细胞质中的一种方法。 因为细胞融合是一个效率很低的步骤，所Wakayama等为了避开细胞融合，采用的一种新方法，胞质内直接注入法可以精确控制核移植后激活的时间间隔，因为，通常应用的电融合方法，在融合时也使卵母细胞得到了激活Lee(2003)等用此方法获得了核移植猪。 徒手克隆 近年来，出现了不需显微操作仪的核移植方法即无透明带移植方法，也有称为“徒手克隆”的。 其基本过程是在去核和融合前除去透明带，将胞质体－－供体细胞复合体进行电融合，构建重构胚。 此技术耗材少，简单快速。用此技术已产出克隆牛，猪，羊 重构胚激活 进核移植形成的重组胚虽然染色体恢复了二倍性，但其胞质还停滞在卵母细胞的MII期状态，想要使其重新进入细胞周期并启动其发育程序，必须通过一定的外界刺激。 所以经核移植形成的重构胚必须通过激活才能启动发育，重构胚的激活在哺乳动物核移植过程中至关重要 重构胚激活的方法 目前大致有三类： 电激活法 --电激活法可产生显著的跨膜Ca2+内流 化学激活法 --学激活是用那些能够激活卵母细胞的化学物质来激活重构胚 精子提取物激活法 --精子提取物激活法是向重构胚内注射精子蛋白提取物来激活重构胚 重构胚培养与移植 核移植重构胚一般要在体外培养一段时间后才移植到受体母体内。 重组胚的体外培养系统一般都采用该物种体外受精胚胎的体外