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DNA的粗提取与鉴定 【复习目标】 1．通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。 2．理解DNA粗提取与鉴定的原理? 【基础知识】 一、提取DNA的方法 提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 1.DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。 ①在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？ ②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？ 此外，DNA不溶于 溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。 2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。3.DNA的鉴定 在 条件下，DNA遇 会被染成 色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 二、实验设计 1．实验材料的选取： 凡是含有 的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量较高的生物组织，成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料（2~3种）：? 鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌? 思考：哺乳动物的红细胞的特点？ 2．破碎细胞，获取含DNA的滤液：?? 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的 ，同时用 搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用 溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的 和 ，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。? 思考：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？? ②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？? ③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?? ④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？? 3．去除滤液中的杂质：??? ?基本原理 方法 目的 DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在的NaCl溶液中的溶解度最低 溶于NaCl溶液中并稀释 ①NaCl溶液浓度为2 mol/L时，DNA溶解，部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质； ②当NaCl溶液稀释至0.14 mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl中的部分蛋白质和其他杂质 DNA不被蛋白酶水解 加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，可水解蛋白质 DNA不溶于酒精溶液 加入冷却的体积分数为95%酒精 析出DNA，除去溶于酒精的蛋白质 DNA水解。 ?②降低分子运动，使DNA易于析出。 ③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。 6．鉴定：? 取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物溶于其中一支试管中，然后向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂，混合均匀，沸水浴加热，待冷却后，比较两支试管的颜色变化。 （二）、动物DNA的粗提取和鉴定 1．材料制备： 0.1G/ml柠檬酸钠100ml 500ml烧杯→玻璃棒搅拌→离心2min→吸去上清液→ 活鸡血180ml 即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀） 2．方法步骤： 取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌 （1）提取血细胞核物质 纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质 原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂 （2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌 （3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液相当于稀释到0．14mol/L） （4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上 （5）（纱布上的）DNA粘稠物再溶解： 20ml 2mol/LNaCl溶液 50ml烧杯，