刘晓东《药物代谢动力学》肝微粒体体外温孵法测定非那西丁代谢速率常数.docxVIP

肝微粒体体外温孵法测定非那西丁代谢速率常数实验报告组员：支卓尔潘诗苑张德铭张鑫男学号：1241613 1241614 1241615 1241616实验材料：1.仪器高效液相色谱仪，台式离心机，离心管，注射器2.试剂非那西丁、对乙酰氨基酚、乙酰苯胺对照品、色谱纯甲醇、乙腈；Tris缓冲液、CaCl2溶液；标准蛋白溶液、考马斯亮蓝试剂、NaCl溶液；NADPH体系（辅酶Ⅱ（NADP）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-P-OH）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P））3.实验动物大鼠，180-220g，禁食不禁水24h肝微粒体制备：取大鼠，禁食24 h后，断头处死放尽血液，迅速剖开腹腔取出肝脏，剪碎肝组织，用预冷的Tris缓冲液(Tris 12.114 g，MgCl2·6H20 1.017 g，HCl 6.93 ml，加水至l000ml)洗净血污，再用滤纸吸干表面水分后称重。按1:3(W/V)加入Tris缓冲液，冰浴，用玻璃匀浆器制成肝匀浆。于4℃12500r/min离心20min，取上清液，与88mmol/L CaCl2混匀（10：1，V/V)，冰浴5min，4℃下27000r/min离心20 min，取沉淀，再用0.1 mol/L Tris缓冲液冲洗(1g肝脏加lml缓冲液)，4℃下27000r/min离心20 min，微粒体以适量Tris缓冲液重悬，-80℃保存备用。体外孵育与肝微粒体样品处理反应总体系体积为200uL。取微粒体80uL（终浓度0.2mg/mL）。非那西丁80uL（终浓度分别为6.25，12.5,25,50,100,200,400uM）。NAPDH再生系统40uL（0.5mM NADP，5mM MgCL2，10mM G-6-P，1U G-6-P脱氢酶）。预温孵5min，37摄氏度温孵30min，加入100uL冰甲醇，涡旋2min，12000rpm，离心10min，取上清，进行HPLC分析。色谱条件：检测波长：254nm，流速：1.0ml/min，柱温：40℃，流动相：40（乙腈）：60（50mM磷酸盐缓冲液）。缓冲液配制（6.8克磷酸二氢钾，150ml氢氧化钠溶液0.1M，配制成1L的缓冲液）进样量：20μl标准曲线制备：180uL大鼠空白肝微粒体，加入20uL不同浓度的对乙酰氨基酚，使其浓度分别为1.56，3.12，6.25，12.5，25,50,100uM。再加入100uL冰甲醇沉淀，涡旋2min，12000-rpm，离心10min，取上清，进行HPLC分析。以峰面积比对应其浓度进行线性回归。浓度uM/mL峰面积 0 0 1.56 19295 3.12 20700 6.25 23625 12.5 34834 25 68093 50 110175 100 212349酶促反应参数计算米氏方程：Lineweaver-Burk方程（双倒数法）：非那西丁uM1/S1/V对乙酰氨基酚uM6.250.161.92 0.5212.50.080.30 3.35250.041.35 0.74500.020.34 2.911000.010.68 1.482000.0050.70 1.434000.00250.10 10.46讨论体外温孵实验结果的回归常数为0.50215，数值比较小，说明本实验结果存在较大误差。对乙酰氨基酚与非那西丁浓度本应成正比关系成递增趋势，而结果与理论值不符，原因可能是进样前上清液与沉淀蛋白未分离直接吸取进样，又因个人操作差异产生一定误差。本次实验涉及到的NAPDH再生系统可能活性不够使得反应程度不够或单个浓度样品间差异较大而产生误差。在本实验中对于仪器的预处理工作不到位，或因仪器准确度不够而使结果异常。