GFP基因的克隆与表达操作步骤.docVIP

GFP基因的克隆与表达 一、碱裂解法质粒DNA的小量提取 所涉及溶液的配制： ? Solution Ⅰ： 50mmol 葡萄糖 25mmol Tris?Cl (pH8.0) 10mmol EDTA (pH8.0) ? Solution Ⅱ： 0.2mol NaOH 1% SDS 使用前现配现用 ? Solution Ⅲ： 每100ml含： 5M KAC 60.0ml 冰乙酸 11.5ml 蒸馏水 28.5ml ? TE Buffer： 10mmol Tris?Cl (pH8.0) 1mmol EDTA (pH8.0) 取单菌落于5ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，于37℃、200-250rpm振荡培养过夜（农杆菌在YEB培养基中，于28℃、250rpm振荡培养，时间相对长些）； 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃、12000rpm离心1分钟，吸弃上清（可重复一次，若菌种需要保存，需要在无菌条件下操作）； 向离心管中加入100－150(l用冰预冷的Solution Ⅰ，用旋涡振荡器或用微量移液器吹打重悬沉淀； 加入200(l新配制的Solution Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次（注意动作幅度不要太大），冰上放置5分钟(仔细观察加入Solution Ⅱ后有何现象出现？)； 加入150(l用冰预冷的Solution Ⅲ，轻轻混匀（观察有何现象出现？），冰上放置3~5分钟； 用微量离心机于4℃、12000rpm离心5分钟，将上清转移到另一离心管； 加等体积酚、酚:氯仿(1:1)、氯仿抽提，振荡混匀，用微量离心机于4℃、12000rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中； 向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4℃、12000rpm离心5分钟，弃上清 用70%乙醇洗涤1~2次，再次4℃、12000rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥10分钟；用适量TE buffer溶解质粒DNA，加入1(l 10mg/ml RNA酶，37℃处理1小时后使用或于-20℃贮存。 DNA的琼脂糖凝胶电泳 1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液) 配1000mL 50xTAE： Tris 242 g 冰醋酸 57 mL 0.5mol／L EDTA 200 mL pH 8.0 2．凝胶加样缓冲液(6x) 溴酚蓝 0.25％ 蔗糖 40％ 3．琼脂糖 4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg／mL 5． DNA 分子量标准 （一)制备琼脂糖凝胶 1） 制备琼脂糖凝胶 实验用1.％琼脂糖。称取1. g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。（2）胶板的制备 将冷到60 ℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)；待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内；加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5 mm。(3) 加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 (4) 电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm，当溴酚蓝染料移动到距凝胶孔道2/3处，停止电泳。(5) 染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200 mL1xTAE缓冲液中加两滴2 mg/mL的溴化乙锭储存液即可)。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。 在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带【注意事项】 1． 在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用 2． 注意安全，防止污染，戴手套操作。 质粒DNA电泳鉴定 样品 3 ul dd H2O 2 ul 6×加样缓冲液 1 ul 总体积 6 ul 重组质粒的酶切鉴定 在