大蒜素协同紫杉醇对肺癌细胞杀伤作用实验探究.docVIP

大蒜素协同紫杉醇对肺癌细胞杀伤作用实验探究[摘要]目的 探讨大蒜素对人肺癌A549细胞周期的影响及其与周期特异性抗癌药物紫杉醇联合使用的抗肿瘤作用。方法MTF法检测大蒜素对肺癌细胞的增殖抑制作用，流式细胞仪检测细胞周期改变，Annexin V－FITC标记法定量检测细胞凋亡，观察大蒜素与紫杉醇联合使用后药物对细胞毒活性的改变。结果大蒜素可明显抑制A549细胞生长，72h药物半数抑制浓度(IC50)为18.55μgml-1；9.30μgml-1大蒜素作用A549细胞24h后，与对照组比较，G0/G1期细胞的百分率明显减少，而G2/M期明显增加(P＜0.05)，大蒜素与紫杉醇联合使用后，紫杉醇72hIC50值由单独应用的9.21μgml-1下降至1.07μgml-1；细胞凋亡率由53.2％增至97.0％。结论大蒜素可将肺癌A549细胞阻滞于G2/M期，大蒜素与紫杉醇联合使用可能具有协同抗肿瘤作用。 [关键词]大蒜素；肺癌细胞A549；细胞周期；紫杉醇 [中图分类号]R734.2；Q813.1　[文献标识码]B　[文章编号]1671－7562(2007)04－0295－04 在肿瘤化疗过程中，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，亦损伤正常细胞。因此，最大限度地发挥抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤作用，同时减少对正常细胞的毒性越来越受到重视。大蒜是百合科葱属植物的磷茎，主要的生物活性物质是其特有的含硫化合物，包括甲基烯丙基硫、二烯丙基三硫、二烯丙基四硫、二烯丙基硫代硫酸酯。二烯丙基三硫又名大蒜素。研究发现大蒜素具有抗肿瘤作用，如可能改变调节致癌活性有关的酶活性，参与提高肿瘤患者的免疫功能，阻滞细胞周期，介导细胞凋亡和分化等。但大蒜素与抗癌药物联合应用的研究不多，本研究将大蒜素作用于人肺癌A549细胞，以研究大蒜素对肿瘤细胞的阻滞作用以及与紫杉醇联合应用对肿瘤细胞的杀伤作用。 1　材料与方法 1．1　材料与仪器 人肺癌细胞系A549细胞、Annexin V细胞凋亡试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司提供，大蒜素注射液由上海禾丰制药有限公司生产，紫杉醇由四川太极制药有限公司生产。RPMI 1640培养基和胰酶购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，噻唑蓝(MTr)、DMSO购自Amresco公司，96孔板购自Costar公司，碘化丙啶(PI)、RNase为Fluka公司产品。FACSean(B.DUSA)流式细胞仪，Bio－RAD Model550(B.DUSA)酶标仪。 1．2　细胞培养 将A549细胞接种在50ml培养瓶中，用含15％小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中培养，细胞贴壁80％时传代，1周传2－3次。实验用细胞为接种24h后的对数生长期细胞。 1．3　MTT法检测大蒜素和紫杉醇对肺癌细胞A549的抑制作用 消化收集对数生长期细胞并调整成浓度为5×104ml-1的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，24h后加入以RPMI 1640培养液配置的大蒜素，终浓度分别为80、40、20、10和5μgml-1，同时设立含RPMI1640全培养基的空白对照组。同法配置紫杉醇，终浓度分别为40、20、10、5和2.5μgml-1。每一浓度设5个复孔，分别继续培养24、48和72h；弃上清液后每孔加MTr50μl，浓度为1mgml-1，混匀，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育4h；弃上清液后每孔加150μl的DMSO溶解蓝紫色颗粒，以酶标仪检测波长490 nm的每孔吸光度值(A值)。实验重复2次，计算细胞抑制率。细胞增殖抑制率＝(1－实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100％。采用LOGIT药物浓度抑制统计分析软件计算IC50值。 1．4　细胞周期分析 用流式细胞仪检测，取生长状态良好的细胞接种在大方瓶中，培养至密度达60％－70％时分别加入不同浓度大蒜素，设立正常对照组，培养72h收集细胞。收集的细胞以PBS洗3次，以70％乙醇4℃固定过夜，1000 rmin-1离心5min，弃去乙醇，PBS洗3次后，加入10μgml-1的RNase于37℃消化0.5 h，加入50μgml-1的PI于4℃染色0.5h，流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析，所用软件为Cellqest。 1．5　细胞凋亡检测 以Annexin V－FITC标记法定量检测紫杉醇和大蒜素联合应用时细胞凋亡的变化。将终浓度为IC50值的大蒜素和紫杉醇分别加入肺癌细胞A549，培养72h；另一组细胞先经浓度为1/2IC50值的大蒜素诱导24h后再加浓度为IC50值的紫杉醇作用72h，并设立正常对照组。细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，PBS清洗2次，于4℃ 2000 rmin-