成纤维细胞及大肠癌细胞相互作用对大肠癌细胞表达EMMPRIN影响.docVIP

成纤维细胞及大肠癌细胞相互作用对大肠癌细胞表达EMMPRIN影响张有为　邓　红　陈平圣　陈露露 [摘要]目的研究成纤维细胞与大肠癌细胞相互作用对大肠癌细胞表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular1ar matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)的影响。方法建立大肠癌细胞SW620与HELF成纤维细胞共培养模型，并设SW620细胞单独培养为对照组，通过RT-PCR和免疫细胞化学方法检测对照组和共同培养组SW620细胞中EMMPRIN的表达。结果共同培养组SW620细胞EMMPRIN的表达在mRNA水平和蛋白水平均高于对照组。结论成纤维细胞与大肠癌细胞相互作用促进了大肠癌细胞EMMPRIN表达增加，EMMPRIN表达增加可能在大肠癌浸润和转移中发挥重要作用。 [关键词]细胞外基质金属蛋白酶诱导因子；成纤维细胞；大肠癌细胞；共同培养 肿瘤细胞的浸润、转移是十分复杂的过程，包括肿瘤细胞与肿瘤细胞、肿瘤细胞与宿主细胞、肿瘤细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)之间的相互作用，以及多种细胞因子的参与、调节。肿瘤细胞逃离原发部位到转移部位，贯穿于整个过程的关键环节是肿瘤细胞的黏附、细胞外基质降解酶的产生和释放。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrixmetalloproteinase inducer，EMMPRIN)作为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的诱导剂，通过调控MMPs合成和降解，在肿瘤细胞的浸润、转移过程中起着重要作用。我们采用体外细胞双层共培养技术，模拟体内情况，研究成纤维细胞与大肠癌细胞的相互作用对大肠癌细胞EMMPRIN表达的影响，初步探讨EMMPRIN在恶性肿瘤浸润和转移中的作用。 1　材料与方法 1.1　试剂与材料 人胚肺成纤维细胞(HELF)(南京凯基生物科技发展有限公司)，SW620大肠癌细胞(浙江大学医学院来茂德教授惠赠)；RPMll640培养基、Hepes(Gibco公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，EDTA(上海试剂一厂)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；微孔底膜套皿(Becton Dickinson Labware公司)；兔抗人EMMPRIN多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司)，Power VisionTM二步法免疫组织化学检测试剂(北京中杉生物技术有限公司)；Trizole(上海申能博彩公司)，引物由上海申能博彩公司合成；RT-PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司)。 1.2　方法 1.2.1　细胞共同培养系统的建立 取对数生长期生长良好的SW620细胞，以每孔1.5×105个接种到双层共同培养板的下层；取对数生长期生长良好的HELF成纤维细胞，以每孔2×105个接种到双层共培养板上层，待2种细胞完全贴壁后将上层套皿放入接种有下层细胞的6孔板中，由此建立细胞共培养系统，此时计为0时刻。对照组：将SW620细胞以相同数量接种于上下层。每组设4个复孔。 1.2.2　RT-PCR检测细胞EMMPRIN mRNA的表达双层共培养板下层的SW620细胞分别在0、12、24、48h时采用Trizole一步法进行总RNA的抽提，取3μlRNA样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。RNA定量后取总的RNA 2μg进行逆转录反应，之后以50μl反应体系进行体外PCR扩增。EMMPRIN上下游引物序列分别为5’－GTGAAGGCTGTGAAGTCGTCA-3’和5’-TYCCGGCGCTI’CTCGTAGATGAA-3’，扩增产物大小为382bp。β-actin上下游引物序列分别为5’-CGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACC-3’和5’-CTAGAAGCATTrGCGGTGGACGATG-3’：扩增产物大小为600bp。反应条件：预变性94度3min，94度变性30s、58度退火30s、72度延伸1min，30个循环后72度延伸7min。PCR产物于117％琼脂糖凝胶中电泳，在图像扫描仪下观察，用SmartView生物电泳图像分析系统处理，并用同一样品的β-actin扩增产物作为内参照进行校正，得出目的条带与内参照条带的吸光度比值。 1.2.3　EMMPRIN蛋白表达的检测采用细胞爬片方法，使SW620生长于玻片上。48h取出玻片，PBS冲洗2次，然后用预冷丙酮固定10min。免疫细胞化学法检测EMMPRIN蛋白表达，操作依照试剂盒说明书进行：PBS冲洗2次，3％Ho237度孵育10min；以PBS 1:200稀释EMMPRIN一抗，4度孵育过夜，PBS冲洗3次；以