核糖体失活蛋白探究应用进展.docVIP

核糖体失活蛋白探究应用进展摘 要 核糖体失活蛋白（RIPs）是一类存在于药用植物和葫芦科植物种子中具有核糖核酸（RNA）N-糖苷酶活力的生物毒性蛋白。文章综述RIPs的提取、分离纯化、化学结构分析、生物活性测定等的研究及其在抗艾滋病病毒和抗癌中的应用进展。? 关键词 核糖体失活蛋白 分离纯化 化学分析 生物活性 应用?? 核糖体失活蛋白（ribosome inactiveting proteins,RIPs）是一类作用于真核细胞中核糖体和裸露原核的核糖体核糖核酸（rRNA），抑制蛋白质合成的细胞毒性蛋白质［1-2］。? RIPs多存在于葫芦科植物的种子中，目前已提取分离出多种不同的RIPs和具有RIP活性的提取物。近年来，随着分离纯化技术和重组DNA技术的发展，RIPs的研究及其在抗艾滋病和抗癌中的应用更有了新的发展。? 1 核糖体失活蛋白的类型? 核糖体失活蛋白（RIPs）已纯化鉴定的主要有：单链核糖体失活蛋白（Single chain ribosome inactivating protein）又称Ⅰ型RIP（RIP-Ⅰ）和双链RIP（double chain RIP）又称Ⅱ型RIP（RIP-Ⅱ）两种类型。? 单链RIP（RIP-Ⅰ）主要的有天花粉蛋白（trichosanthin,TCS），α-丝瓜蛋白（α-luffin）和β-丝瓜蛋白（β-luffin），α-苦瓜蛋白（α-momorcharin,α-MMC）、β-苦瓜蛋白（β-MMC）、δ-苦瓜蛋白（δ-momorcharin,δ-MMC），苦瓜抗HIV蛋白（momordica anti-HIV protein,MAP30）、泰国苦瓜蛋白（MRK29）及木鳖子素（cochinchinin）等。? 双链RIP（RIP-Ⅱ）主要的有：r-苦瓜蛋白（r-momorcharin,r-MMC）及蓖麻蛋白（ricin）。? 2 RIPs的提取纯化和分析鉴定? 2.1 天花粉核糖体失活蛋白? 早在1976年中国科学院有机化学研究所对葫芦科栝楼属植物栝楼的块根天花粉活性成分研究中即已提出一种蛋白质。1981年金善炜等［3］在他们的早期制备方法和其他作者的研究基础上提出了分离、纯化方法获得天花粉蛋白。纯的蛋白命名为天花粉蛋白（TCS）。分离纯化流程见图1：? 天花粉蛋白（TCS）经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）、双向PAGE和琼脂聚糖免疫电泳，结果均显示均一的蛋白质。? 1986年汪猷等发表了天花粉蛋白一级结构。1990年美国Collins等报道了α-天花粉蛋白的一级结构。两者间有43个氨基酸残基有差别，特别是在溴化氰降解片段CB1和CB4中的序列差别较大。1993年汪猷等［4］报道了天花粉蛋白一级结构的修正及不同产地天花粉蛋白的研究。胰蛋白酶酶解天花粉蛋白用高效液相色谱分离酶解肽段，用序列仪测定其肽段序列，用羧肽酶A，B，Y测定天花粉蛋白C端和天花粉蛋白溴化氰降解肽CB1的C端序列，修正了他们在1985年测定的天花粉一级结构，证明了天花粉蛋白由246（7）氨基酸残基组成，除C-端微观不均一外，与Collin’s报道的结果一致。同时比较了安徽芜湖产的和浙江平湖产的天花粉蛋白一级结构，没有发现一级结构有差别。? 2.2 丝瓜核糖体失活蛋白? 1983年Kishida等首先从丝瓜籽中提取出了丝瓜蛋白（luffin），1988年kamenosono等进一步分离出α-丝瓜蛋白（α-luffin）和β-丝瓜蛋白。? 1995年吴伸等［5］用一种改进的方法，简便快速地从丝瓜（Luffa cylindrica）籽中分离纯化得到α-丝瓜蛋白和β-丝瓜蛋白。? 选取纯黑颗粒饱满的丝瓜籽，洗净后用10倍体积浸泡液浸泡，打碎，过滤，调节至PH4.0，4℃搅拌2h，超速离心，调节至7.0。重复离心，加（NH4）2SO4至饱和，冰箱放置过夜，离心得白色微黄沉淀。用Bis-Tris缓冲液溶解，除去不溶物在Sephadex G-25柱脱盐，洗脱液上S Sepharose Fast Flow离子交换柱，洗脱，部分收集，经无细胞系统测活，取活性的两个部分，分别用Sephadex G75色谱柱纯化，用Bis-Tris（PH7.2）缓冲液洗脱，再用Sephadex G-25脱盐，冷冻干燥，即得。? 两种蛋白经SDS鉴定，分子量分别为?28 000至?29 000左右，其等电点均为10.0，可确认为α和β-丝瓜蛋白。? 2.3 苦瓜核糖体失活蛋白? 早在1980年Barbieri等［6］从苦瓜Momordica charantia种子中分离出体外抑制蛋白质合成的4种蛋白