通过断裂内含肽介导的反式剪接合成大的蛋白.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１２）：７４～７８ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 技术与方法 殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 通过断裂内含肽介导的反式剪接合成大的蛋白 张　静　刘　环　周　晶　刘建华 （上海交通大学生命科学技术学院　上海　２００２４０） 摘要　大肠杆菌难以表达大的蛋白，毒性蛋白以及膜蛋白，“ＮｐｕＤｎａＥ内含肽表达系统“使这些 蛋白的表达成为可能。该系统的基本原理是：在特定位点处将目标基因（编码Ｔ７ＲＮＡ聚合酶的 基因）断裂成两部分，然后分别与ＮｐｕＤｎａＥ内含肽的Ｎ端，Ｃ端片段融合，两种融合基因分别表 达纯化，在体外将两种融合蛋白等摩尔比混合即可产生有功能的Ｔ７ＲＮＡ聚合酶。理论上，该体 系也可用于合成其他大的蛋白，毒性蛋白或膜蛋白。 关键词　大的蛋白　毒性蛋白　膜蛋白　ＮｐｕＤｎａＥ内含肽　Ｔ７ＲＮＡ聚合酶 中图分类号　Ｑ８１９ 　　蛋白质剪接是一种翻译后成熟的过程，在此过程 前者具有更高的剪接活性。ＮｐｕＤｎａＥ内含肽融合蛋白 中，一种命名为“内含肽“的插入序列能进行自我剪接， 有５５％～９０％转化成剪接产物，并且仅有少量的Ｎ端 ［１］ ［１５］ 以肽键连接两侧外蛋白子形成成熟蛋白质 。有些编 和Ｃ端切割产物 。综合考虑，我们决定利用 Ｎｐｕ 码内含肽的基因在特定位点处断裂成 Ｎ端片段（简称 ＤｎａＥ内含肽来合成大的蛋白。 Ｎ Ｃ Ｉ）和Ｃ端片段（简称Ｉ），这两部分单独存在时没有活 　　我们将ＮｐｕＤｎａＥ断裂内含肽与大肠杆菌Ｔ７蛋白 性，但当断裂内含肽的 Ｎ Ｃ 表达系统相结合，构建了一套体外Ｔ７表达系统。该策 Ｉ和Ｉ混合时，两者相互识别， ［２～５］ 略将Ｔ７ＲＮＡ聚合酶在特定位点处断裂成Ｎ端和Ｃ端 重建催化活性中心，介导蛋白质反式剪接 。蛋白质 反式剪接在生物学上已经得到了广泛应用，包括蛋白 两部分，然后分别与 ＮｐｕＤｎａＥ内含肽的 Ｎ端片段 ［６］ ［７～９］ （ＤｎａＥ）和Ｃ端片段（ＤｎａＥ）相融合。这两种融合蛋 半合成 ，蛋白环化 ，对蛋白部分片段进行同位素 Ｎ Ｃ ［５］ ［１０～１２］ 白分别表达，纯化，然后在体外混合。最终通过 Ｎｐｕ 标记 ，蛋白开关 ，以及在转基因植物中激活某 ［１３］ ＤｎａＥ内含肽介导的反式剪接产生有功能的Ｔ７ＲＮＡ聚 些基因 。　　蛋白反式剪接已成功地应用于腺病毒 ［１４］ 合酶。 介导的体内基因治疗中 。他们将 ６．３ｋｂ长的ｄｙｓ ｃＤＮＡ断裂成两部分，分别与断裂内含肽的Ｎ端和Ｃ端 １　材料与方法 片段连接。这两种融合基因分别克隆到ＶＶ１载体中。 同时将这两种载体导入ｍｄｘ鼠中，通过上述两种融合 １．１　材　料 蛋白有效地剪接产生全长的Ｂｅｃｋｅｒ型肌萎缩蛋白。这 　　大肠杆菌 ＥＲ２５６６购自美国ＮＥＢ公司；大肠杆菌 ＤＨ５ 和 ＮｉＮＴＡ树脂购自美国 Ｎｏｖａｇｅｎ公司；质粒 项研究成果给难表达蛋白的合成带来了曙光。 α 　　目前 ＳｓｐＤｎａＥ内含肽是用得最广泛的断裂内含 ｐＬＩＣ１，ｐＬＩＣ２为本实验室构建；质粒小量抽提试剂盒、 肽。而 Ｉｗａｉ等报道的 Ｎｏｓｔｏｃｐｕｎｃ