金黄色葡萄球菌肠毒素实验研究.docVIP

金黄色葡萄球菌肠毒素实验研究金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都能分离到。健康人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等也常带有产肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株，因此，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒问题是个世界性卫生问题，在美国由其引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%［1］。我国每年发生的此类中毒事件全国各地都有报道。金黄色葡萄球菌肠毒素是一类结构、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE 5种（其中血清型SEC又分为SEC?1、SEC?2、SEC?33种亚型）早已被鉴定的传统血清型外，近年来还发现了SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO和SEU等新型的肠毒素［2-7］。本实验对一起食物中毒事件中分离到的13株金黄色葡萄球菌分别用全自动酶联荧光免疫分析法（VIDAS法）、反向胶乳凝集试验法（RPLA）及聚合酶链式反应法（PCR）进行肠毒素检测，并对这3种方法的检测结果进行分析，最后用DNA指纹图谱法对其进行同源性比对，从而了解金黄色葡萄球菌肠毒素的分布情况。?? 1材料与方法? 1.1材料? 1.1.1菌株来源实验所用的13株菌株均来自杨浦区疾病预防控制中心，是从一起食物中毒采集标本中分离所得，并已鉴定为金黄色葡萄球菌。其中1号和2号菌株从2位病人的肛拭中分离得到，其余9株从与这起食物中毒有关的环节中分离得到，包括炊事员的手、外环境等。? 1.1.2仪器与试剂mini VIDAS 全自动酶联荧光免疫分析仪、RiboPrinter指纹图谱仪为美国杜邦公司产品；PCR预混反应液购自上海皓嘉科技发展有限公司,寡核苷酸引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；金黄色葡萄球菌肠毒素反相被动胶乳凝集试验（RPLA）试剂盒购自OXOID公司。? 1.1.3引物选择根据 Becker等［8］报道合成SEA、SEB、SEC、SED、SEE 基因的PCR引物；根据Jarraud 等［9］报道合成SEH、SEI、SEG基因的PCR引物；根据Steven等［10］报道合成SEJ基因的PCR 引物,见表1。 ?? 1.2方法? 1.2.1测定肠毒素将分纯的金黄色葡萄球菌接种于BHI肉汤，37℃震荡培养过夜。次日以3000 r/min离心15 min，取上清液2mL再次离心后，将1mL上清液加到1 mL提取缓冲液中混匀，然后取0.5 mL上述混匀液加入SET 2试剂条孔内，用VIDAS 全自动定量酶联荧光免疫测试系统检测肠毒素。? 1.2.2RPLA法肠毒素分型用Oxoid公司的RPLA试剂盒检测A、B、C、D 4种类型肠毒素，根据试剂盒说明书方法检测。? 1.2.3PCR法肠毒素分型①模板DNA的制备将平板上的纯菌落加入到100μL裂解液中，100℃裂解10min，然后以12 500 r/min离心10min，取上清液即为PCR扩增模板。 ②PCR扩增扩增反应总体积为25 μL，其中预混反应液12 μL，模板DNA 2 μL，上游引物(10μmoL/L)1 μL,下游引物（10μmoL/L）1 μL，灭菌双蒸水9 μL。DNA扩增反应条件如下：预变性94℃ 5min，然后进行35次循环的94℃变性 1 min， 55℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延长延伸时间至10 min。上述引物包括SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ 9对引物。③电泳PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1.5%，所用的DNA标准分子量（Marcker）购自美华生物工程公司。 ④凝胶成像用凝胶成像仪（中国天能公司）观察PCR扩增条带，并拍照留存。? 1.2.4基因指纹图谱的测定提取13株金黄色葡萄球菌DNA后，选择EcoR I内切酶试剂盒，用Ribo Printer??全自动微生物鉴定系统进行基因指纹图谱的测定，操作步骤按操作手册进行?? 2结果? 2.1VIDAS测定肠毒素? 经过上机快速筛选，13株菌株中8株金黄色葡萄球菌肠毒素检测阳性。RPLA试剂盒进行分型试验，结果有2株鉴定为A型，1株为B型，1株为C型，2株为D型。PCR基因分型结果为4号菌株同时带有肠毒素A、E型基因，5号菌株同时带有肠毒素D、I、G、J型基因，8号菌株同时带有C、D、I、G、J基因，见表2。?? 2.2电泳? 金黄色葡萄球菌肠毒素基因SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ扩增片段大小和文献报道一致，电泳图见图1。 2.3检测? Ribo Printer系统对13株金黄色葡