噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 - 自然科学版.PDF

维普资讯 第 19卷第 2期 青 岛 大 学 学 报 (自然 科 学 版 ) V。1．19N。．2 2006年 6月 JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY (NaturalScienceEdition) Jun．2006 文章编号：1006 1037(2006)02 0074—05 噬夏孢欧文氏菌类 crtB基因的克隆 及在大肠杆菌中的表达 汪靖超 ，姜 颖 ，杜桂彩 ，郭道森 ，李荣贵 (青岛大学生物系，山东青岛266071；2．青岛大学天然色素省重点实验室，山东青岛266071) 摘要：噬夏孢欧文氏菌类胡萝 b素合成相关基因crtB，编码八氢番茄红素合成酶。利用 PCR技术扩增出crtB基凶，克隆进表达载体，构建表达质粒pET一15bcrtB。重组质粒转 化大肠杆菌，构建工程菌株。经 IPTG诱导，工程菌高效表达了重组八氢番茄红素合成 酶，表达量 占菌体总蛋 白的 40 。重组蛋 白以包含体形式存在，包含体经洗涤、尿素溶 解、复性并经镍离子树脂亲和层析、Superdex75凝胶层析柱纯化，得到了电泳纯的重组八 氢番茄红素合成酶，带有His—tag的该蛋 白分子量为35kDa，pI值为7．3。 关键词：Er~,iniauredowora；crtB；八氢番茄红素合成酶；表达；纯化 中图分类号 ：Q786 文献标识码 ：A 类胡萝 b素在猝灭 自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人体健康方面起着非常 重要的作用～ 。所有的类胡萝 b素都是通过类异戊二烯途径或类萜途径得到的。IPP(异戊烯焦磷酸)是 该途径的前体物质，首先 IPP在 IPP异构酶催化下异构成DMAPP(二甲基丙烯基二磷酸)，然后DMAPP在 GGPP合成酶的催化下先后与3个 IPP分子缩合而成GGPP(栊牛儿基栊牛儿焦磷酸)；2分子GGPP在八 氢番茄红素合成酶的催化下形成八氢番茄红素，它是整个类胡萝 b素合成途径中的第一个类胡萝 b素分子。 在八氢番茄红素脱饱和酶催化下，八氢番茄红素经过连续的脱氢反应，共轭双键延长，直至形成番茄红素；番 茄红素继而在番茄红素环化酶的催化下生成 l3一胡萝 b素、a一胡萝 b素或 6一胡萝 b素，然后可进一步形成 结构更为复杂的叶黄素 。 噬夏孢欧文氏菌 (Er~,iniauredowora)基因crtB编码八氢番茄红素合成酶一，本研究利用PCR技术，从 噬夏孢欧文 氏菌基 组中扩增出crtB基因，构建重组表达质粒 pET一15bcrtB，转化进宿主菌E．coliBL21 (DE3)中，高效表达出了重组蛋 白；菌体内的重组蛋 白变性冉复性后，经镍离子螫合树脂亲和层析及Super— dex75凝胶过滤层析，得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌八氢番茄红素合成酶，为进一步研究该酶的理 化性质及噬夏孢欧文氏菌类胡萝 b素的合成机制打下了基础。 l 材料与方法 1．1 材料 噬夏孢欧文氏菌E．A1YedowoYa20D3(ATCC19321)购 自美国模式菌种收集中心(ATCC)，引物由上海 生工生物工程技术有限公司合成，克隆所需工具酶购 自大连宝生物T程公司，ChelatingSepharose4B为 Amersham公司产品，Superdex75为 Pharmacia公司产品，其他试剂均为国产分析纯 。 1．2 方法 收稿 日期 ：2006 03 20 基金项 目_LⅡ东省优秀中青年科学家奖励基金(2003)．青岛市 自然科学基金资助项 目(05—1一Jc一91) 作者简介 ：汪靖超 (1973 )．男．山东泰安人 ．讲师．研究方向为分子生物学。通讯作者：李荣贵．Email：rongguili@yahoo，com 维普资讯 第2期 汪靖超，等：噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 1．2．1 噬夏孢欧文氏菌基凶组 DNA的提取 参照 Masawa等 I的【方法进行。 1．2．2 cr