尿激酶制取与检验.doc

尿激酶的制取和检验 摘要：尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH 8.7左右。目前我国主要从男性尿液中提取尿激酶有三种方法:浸泡法、沉淀法、吸附法。生产上多采用吸附法,根据选用吸附剂的类型又分为树脂吸附和硅藻土吸附两种工艺。成品尿激酶为无色（或米色）澄清或白色冻干粉末，每毫克蛋白的活力不得低于120000IU。 关键词：尿激酶；性质；工艺；检验方法；质量标准； 正文： 尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物。它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶, 纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽,从而使血栓溶解。因此, 临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时, 由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白,使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞, 从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以,尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂,而且它是无抗原性问题,可长时间使用。 一、产品性质 尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH8.7左右。为白色非结晶状粉末,易溶于水。稀溶液性状不稳定,必须新鲜配用,且不得用酸性溶液稀释。冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似,也有酯酶的活力。无抗原性，不使体内产生抗体。体内半衰期为(14±6)min。 尿激酶主要有高分子尿激酶(H-UK),分子量为54000和低分子尿激酶(L- UK),分子量为34000两种,前者为天然存在形式,后者为H-UK的降解产物。这两种UK均有生物活性,但从体外进行的酶动力学试验和临床表明,H-UK比L-UK更有效,因此临床使用上均要求以它为主的产品。 二、尿激酶制法 自20世纪70年代以来,尿激酶的制取方兴未艾,精制方法多有报道,但回收率偏低。我国人口众多,尿源十分丰富,因此以尿为提取尿激酶的原料,比较适合我国国情。由于尿激酶在尿中含量很低,从尿中提取尿激酶的关键是选择恰当的吸附剂。目前我国主要从男性尿液中提取尿激酶有三种方法:浸泡法、沉淀法、吸附法。生产上多采用吸附法,根据选用吸附剂的类型又分为树脂吸附和硅藻土吸附两种工艺。 2.1主要仪器及试剂: 752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂生产);Sephadex G-50,CM- Sephadex C-50,Bio-GelP-30(Pharmacia);人纤维蛋白原(上海生物制品研究所生产)；尿激酶标准品,凝血酶,纤维酶原(中国药品生物制品检定所生产)；其他试剂均为国产分析纯或化学纯。 2.2 UK粗品制备: 吸附:用搪瓷缸收集新鲜男性尿,在搅拌下加尿量0.12%(W/V)HD-2树脂,搅拌吸附50min。用尼龙布过滤,弃去尿液,收集树脂装柱； 洗脱:将树脂用少量水洗涤后用0.1%氨水(电导率为22.5mΩ)洗脱,收集洗脱液，回收树脂； 盐析:将洗脱液移入搪瓷桶中,在搅拌下加入固体硫酸铵粉末至0.65饱和度,待全部溶解后,在0℃放置6~8h,然后过滤,收集盐析物,即得到粗品。 Sephadex G-50凝胶过滤除盐:将UK粗品用预冷至0~5℃的无热原蒸馏水溶解,制成UK含量为(2~3)×104IU/mL的UK水溶液,立即用冷冻离心机分离,收集上清液,用2mol/L盐酸或2mol/L氢氧化钠溶液调pH6.5。将此溶液上Sphadex G-50凝胶柱(此柱预先用pH6.5,0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡),上样体积控制在柱床体积的15%~25%,收集流出液中含UK部分。 GM-Sephadex C- 50离子交换层析:将上述收集到的UK溶上GM-Sephadex C- 50离子交换层析柱(此柱预先用PH6.5,0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡),加一个床体积的柱平衡液洗涤后,用0.6mol/L的氯化钠溶液洗脱,收集UK活力部分。 硫酸铵沉淀:在上一工序收集的UK溶液中缓缓加入固体硫酸铵(每升溶液加430克),边加边搅拌,直至加入的硫酸铵溶解,随即用冷冻离心机分离,收集UK沉淀物。 Bio-Gel P-30凝胶过滤:将UK沉淀物用0~5℃的无热原蒸馏水溶解,制成UK含量为(5~10)×10-4IU/mL的溶液,上Bio-Gel P-30凝胶柱(此柱预先用0.3mol/L的氯化钠溶液平衡),上样量控制在柱床体积的8%~12%,随时监测流出液的UK活力,收集第一个流出峰部分,即H-UK部分。 产品的除菌及冷冻干燥:将上工序收集的H-UK溶液添加1%~5%的甘露醇做赋形剂(加量多少依产品效价要求和冷冻干燥情况而定),用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后,立即进行冷冻干燥,冷冻干燥后的UK为粉状产品,密封于容器内置0~5℃下保存。 三、尿激酶检验 3．1生物学活性测定 采用溶圈法。称取125mg琼脂糖,加入