ELISA的爱与愁.PDF

費軫尹 撰 ELISA的 愛與愁 酵素連結免疫吸附法 的煩惱就交給專家吧！ 　 EL ISA（ Enzy me- linked Immuno- So rbe nt A ssay， 酵 素連結 免疫 吸 附法） 在 現代 是個 不 可 或缺 的技術， 它可以在短 時 間 內定 量 多個 檢體 的特 定分析 物（a na lyt e） 的濃度， 對 實驗 室 來說 是非 常方便 的技術 。但 若 除卻 市售 的 EL ISA 套 組， 許 多實驗 室 自行製作 的 EL ISA 卻 常面 臨分析 不穩 定 的狀 況； 造成 EL ISA 結 果 不穩 定 的原 因有很 多， 本 文將就 一 些實驗 室 常見 問題 ， 提供 完整 的解 決方案： 1. 高背景值 High Background： 1. 1 清洗 步驟不確 實： 　 清 洗 步驟 在 EL ISA 過 程 中扮 演很 重 要 的 角色， 藉 由此 步驟 去 除非 專 一性 或親 和 性 低 的 反應物 的干擾， 亦 可降 低 背 景 值 所 造成 對結 果 判 斷 的影響 。清 洗 緩衝 液（w as hing buff e r ）的 組 成 更是決 定清洗 步驟 的關鍵， 不僅 要能夠 有效洗 去非反應物 的干擾， 也 不能 影響 抗 體 和 反 應 物 的生物 特 性 、甚 至破 壞 二 抗 的酵 素 活 性 。最 常使 用 的 w as hing buff e r 為 PBS 、T ris sa line 、以imid iz o le 為基 底 的 中性 buff e r 等 等 。若 酵 素 為 A P 系統， 可將 w as hing buff e r 之 p H 值調為 9- 10，可 有效 增加 A P 酵素活性， 但 需避 免 p hos phat e b uff e r 以免 A P 受到干擾； 而 H RP 酵素系統 則 需注 意避 免使 用 Sod ium Az ide 。 　 為 了有效降低非專一性結 合，w as hing b uff e r 中可添加 界面活性劑， 例 如 Tw ee n-2 0 或 T rit o n X - 100；如 果 已 從 EL ISA 結 果 確 認 背 景 值 太 高 ， 也 有 文 獻 指 出， 可 在 w as hing buff e r中添加 一些蛋 白質加強 或改善 。 　 當然， 清洗過程 也很 重要： 通 常每次 w as h 都 需進行 3～5 次， 每次 可持 續 5～10 分鐘 。 如果 實驗 室並非使 用專業 was he r，而 是使 用人 工手動清洗， 則 需特別注 意： 在 每一步將殘 液甩掉， 並且不應 讓 E L ISA 盤 在清洗過程 中過度 乾燥 。 20 1.2 二 抗添加 量太 高： 　 當 二抗添加 量太 高時， 再 多的清洗 步驟也 無法完全將背景干擾 去 除； 此時該確 認二抗稀 釋倍 數 是否太低， 造成 反應濃度過 高 。而 每一次 更換 不 同批 號 的抗體， 都 應 重新確 認稀 釋 倍 數 是否適 當 。 1.3 B loc king 不足： 　 將 抗體 或抗原 coat ing 在 E L ISA 盤 後，E L ISA 盤 上一定會 有殘餘 的疏水性 空 間（h y d ro- pho bic s it es）；這 些 空 間必須 藉 由 Bloc king 來填 充這 些 空 隙， 以避 免 反應物 或後 續 抗 體 抗原 卡在這 些 空隙而導致 非 專一性結 合與 高背景值 。通 常都 是使 用不 同蛋 白來 b loc king， 例 如 BSA 、脫脂 乳粉 、case in 或 ge lat in 等； 不 同蛋 白之使 用濃度 不 同， 若 背 景值 高時， 可提 高 b loc king b uff e r 中蛋 白含 量， 使填 充效果 更好 。有些抗體 的專一性 不夠， 反而容易