实验一培养基配制和灭菌.docVIP

实验一　　培养基的配制与灭菌 一、目的 　学习并掌握培养基配制及灭菌的方法 二、原理 培养基 　在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供 不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。培养基通常包括下列成分（表1） 　　　　　　　　　　　表1　　培养基的组成成分及其作用 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 类别 成分 作用 无机物 大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：Fe、B、Mn、Cu、 Zn、Mo、Cl、I、Co等 植物生长必需的营养元素 有机物 营养物：糖类、氨基酸及酰胺类 生理活性物：维生素等　 为植物细胞提供C、H、O、N等必要元素 作为生理活性物质在细胞代谢中起一定作用 植物生长调节剂 植物天然的五类激素及其人工合成的类似物 作为生理活性物质参与植物生长发育的调节 附加物 如琼脂、活性碳等 有利于植物细胞生长 其他未知复合成分 如椰子汁、酵母提取物、香蕉、西瓜水、马蹄汁等 供给一些必要的微量营养成分、生理活性物和生长激素等 　配制培养基可以直接称量，但为了减少称量麻烦和提高称量的准确性，通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用时按比例稀释。一般要配下列母液： 微量元素母液：除铁盐外的其它微量元素盐类的混合液，通常配成1000× 2、有机化合物母液：通常配成100× 3、铁盐母液：铁盐与其它无机物成分混合易沉淀，须单独配制。浓度为1000× 4、激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg到1.0mg/ml不等。 5、10×大量元素母液：培养基除激素、糖、琼脂外，其他成分混合配成10倍液，分装后置于冰箱冷冻格保存。用时取适量该母液，加入激素、糖、琼脂、水等配成常用培养基。 　　(二) 培养基的灭菌： 　　培养必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，而导致外植体死亡。灭菌方法下列几种： 高温高压灭菌法：将培养基放入高压锅内，在1210C、108KPa(1.1kg/cm2)的压力下持续约20分钟。 过滤除菌法：带菌的溶液通过孔径为0.22μm(或更小)的微孔过滤器装置后，杂菌阻隔留在滤膜上，而溶液进入无菌空瓶内，从而达到除菌的目的。此法用于不能以高温高压灭菌的培养液或酶液的除菌。 3. 60Coγ射线法：用γ射线过量照射以灭菌。可用于大量灭菌，但设备昂贵。 三、仪器设备及用具 仪器设备 万分之一电子天平 百分之一电子天平 超净工作台 高压锅 酸度计 磁力搅拌器及搅拌子 不锈钢过滤器 玻璃蒸馏水器 家用冰箱 用具 烧杯：100ml×1， 500ml×1 ； 量筒：100ml×1， 250ml×1 磨口试剂瓶：100ml×1， 500ml×1；带盖试剂瓶：500ml×2 三角瓶： 100 ml×1，250 ml×1 药匙、称量纸、牛皮纸、棉花塞、橡筋：若干 试剂 1N HCL 02N KOH 蔗糖（分析纯） 琼脂粉 N6大量：KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2P O4 (NH4)2SO4 B5微量：KI H3BO3 MnO4·H2O ZnSO4·7H2O Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCL2·6H2O Na2EDTA FeSO4·7H2O B5有机：盐酸硫胺素 盐酸吡哆醇 烟酸 肌醇 谷氨酰胺 水解酪蛋白 脯氨酸 2、4－D 6-BA NAA 　　五、实验步骤 （一）配母液 B5微量元素母液（1000×/100ml）：按配方的1000倍用万分之一天平依次称量，搅拌溶解(溶解一种后再加另一种)后定容。用量极少的成分(如CuSO4·5H2O、CoCL2·6H2O、Na2MoO4·2H2O)即使按1000倍称量仍很困难。 N6大量元素母液（10×）、B5有机成分母液（100×）：配法同1。 2，4-D母液(0.5mg/ml)：用万分之一天平称取2，4-D 50mg→用少量95%乙醇溶解→加水定溶为100ml. 6-BA母液（1mg/m l)：用万分之一天平称取6-BA 100mg→用少量1N盐酸溶解→加水定溶为100ml. NAA母液（1mg/m l)：用万分之一天平称取NAA 100mg→用少量95%乙醇溶解→加水定溶为100ml. 铁盐母液（1000×/1000ml）：用百分之一天平称取FeSO4·7H2O 27.8g， Na2EDTA 37.3g→分别置于1000ml和500ml烧怀，各加水500ml→ 以上各母液配好后分别装入磨口试剂瓶，贴上标签，写明名称、浓度和配制日期，置