RAPD的分子标记技术.PPT

第十七章 分子标记辅助选择育种Chapter 17 Molecular Marker assisted Selection Breeding 标记辅助选择育种: 是利用与育种目标性状基因紧密连锁的遗传标记,对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。 常用的标记主要有四种: 第一节 分子标记的类型和作用原理 一、分子标记的类型和特点1.类型（按技术特性分类） 2.原理 二、分子标记的原理和遗传特性 (一)RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)标记 1.RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。 2.RFLP标记的特点 （1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的； （2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限制； （3）共显性，可区分纯合子和 杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂,难以用于大规模的育种实践中 它是Randomly Amplificd Polymorphic DNA的英文缩写,中文意思是随机扩增多态性DNA,RAPD技术是1990年由美国杜邦公司的科学家Williams和加利福尼亚生物研究所Welsh领导的两个科研小组几乎同时发展起来的。 1.RAPD标记的原理 它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。 2.基本流程 3.RAPD标记的特点 ①RAPD使用的是随机引物，不需要预先了解目的的基因和相应的序列。 ②操作简便，实验周期短，能在较短的时间筛选大量样品。 ③引物具有普遍适就性，适用于自动化操作分析。  （三）AFLP标记 扩增片段长度多态性Amplified?fragment?length?polymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA?多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。 1.AFLP标记的原理 以PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 2.实验流程 1、?总DNA提取 2、??EcoR1酶消化 3、Mse1酶消化 4、T4 DNA Ligase 5、?预扩增 6、选择性扩增 7、产物电泳检测 3.AFLP分子标记的特点 （1）不需要事先知道DNA序列的信息，可以用于任何动植物基因组的研究。 （2）多态性丰富 （3）标记多数具有共显性表达，无复等位效应，表现孟德尔方式遗传。 （4）分析成本较高，对DNA的纯度和内切酶的 质量要求也较高。 (四)SSR 1.SSR标记的原理 根据微卫星DNA两端的单 拷贝序列设计一对特异引 物，利用PCR技术，扩增每个 位点的微卫星DNA序列，通过 电泳分析核心序列的长度多 态性。 2.SSR标记的特点 （1）SSR标记为共显性标记，可鉴别出纯合子和杂合子。 （2）重复性高，稳定可靠。 （3）DNA用量少，对DNA的质量要求也不太高。 （4）使用SSR技术需要知道重复序列两翼的DNA序列。 以PCR(聚合酶链式反应)为基础的分子标记 PCR (Polymerasc Chain Rcaction),又称无细胞分子克隆法,是近年来发展起来的一种快速的特定DNA片段扩增技术。它是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(In Vitro)的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍,从而从中筛选出所需的目的DNA 。 标准的PC