早期自然流产及精子DNA完整率相关性探究.docVIP

早期自然流产及精子DNA完整率相关性探究【摘 要】 目的:研究早期自然流产与精子DNA完整率之间的相关性。方法:取早期自然流产组病例70例,取不育组病例110例,吖啶橙法进行精子DNA完整率检测,精子DNA完整率≤70%视为异常。结果:早期自然流产组精子DNA完整率≤70%病例32例,不育组精子DNA完整率≤70%病例25例,两组异常比例分别为45.7%和22.7%。结论:早期自然流产组精子DNA完整率异常比例显著高于不育组,提示精子DNA完整率异常可能是导致早期自然流产的原因之一。 【关键词】 早期自然流产; 精子DNA完整率 自然流产是妇产科常见病,发生率约占临床妊娠的10%~20%,且绝大多数发生于孕早期(孕前3个月),实际上亦可归纳为一种不育症。其病因复杂,涉及到遗传、解剖、免疫、内分泌、感染、血栓形成倾向甚至环境及其他未知因素[1]。目前的研究仍主要集中在女性方面,即使做了详尽的病因筛查后,仍有超过50%的病例原因未明[2,3]。 研究表明,胚胎的染色体异常或基因异常是导致早期自然流产的主要原因,且流产次数与胚胎染色体或基因异常发生率之间无明显关联[4]。然而,外周血染色体核型分析只能为2.4%~5.0%的自然流产患者找到原因[5,6],提示研究配子阶段的染色体异常或基因异常对于揭示早期自然流产病因或许更有意义。 精子作为父源性遗传信息承载物,其基因内容占胚胎遗传物质的一半。国外的研究表明,精子DNA完整性程度与自然受孕率及不明原因自然流产都具有显著相关性[7,8]。本文通过对不育组及早期自然流产组病例精子DNA完整率的检测并进行统计学分析,探讨早期自然流产可能存在的男方因素,从而为不明原因早期自然流产的诊断及治疗提供一条新的思路。 1 材料与方法 1.1 病例来源与标本制备 1.1.1 病例来源纳入标准:随机选择门诊有过1次或1次以上早期自然流产病史夫妇男方病例?70例作为病例组;随机选择门诊不育夫妇男方病例110例作为对照组。排除标准:病例组由于外力因素造成早期自然流产者不纳入;对照组已明确女方双输卵管阻塞、卵巢功能衰竭者不纳入。 1.1.2 标本制备 两组病例要求禁欲3~7天,手淫法采集精液,排除近期发热史及不良环境接触史,无近期服药史。取液化精液1.0ml,用PH7.4、0.01mol/L PBS液洗3次,去上清调整精子密度为20×106/ml,涂片,晾干,甲醛固定。 1.2 仪器、试剂与实验方法 1.2.1 仪器 精子分析仪;荧光显微镜。 1.2.2 试剂 吖啶橙染液:吖啶橙0.1g加蒸馏水至100ml;枸橼酸液:枸橼酸1.91g加蒸馏水至100ml;Na2HPO4、12H2O液:Na2HPO4、12H2O 10.74g加蒸馏水至100ml。上述原液储存于4℃冰箱备用,用前按吖啶橙染液1.0ml、枸橼酸液4.0ml、Na2HPO4、12H2O液0.25ml的比例配制。 1.2.3 检测方法 用新鲜配制的吖啶橙混合染液对已涂片固定的精液标本染色5min,水洗、晾干后用荧光显微镜高倍镜观察。计数300条精子,计算出正常具有稳定双链DNA精子(染为绿色)的百分率,其值即为精子DNA完整率,正常参考值为大于70%。 2 结果 病例组精子DNA完整率异常病例32例,占45.7%;对照组精子DNA完整率异常病例25例,占22.7%。病例组精子DNA完整率异常比例显著高于对照组,故精子DNA完整率异常可能是导致早期自然流产的重要原因之一。见表1。 3 讨论 近年来,精子DNA完整性一直是生殖医学领域的研究热点之一。Evenson等于1980年建立起精子染色质结构分析(SCSA)的方法,SCSA的参数为DNA片段指数(DFI)。DFI的临界值已确定:所有正常生育男子的DFI值均小于30%[9,10]。本文精子DNA完整率其含义为1-DFI,故其正常参数值为大于70%。 人类胚胎细胞分裂是靠男性精子提供中心粒完成的[11]。在精子产生过程中,如果表达微管的基因受损,受精卵和胚胎将会因停止发育而导致流产。 精子的功能是将父源性遗传基因传递给子代。部分早期自然流产病例,男方的精液常规、精子形态及精子染色体核型均无异常,此时精子DNA损伤在预测流产原因时往往被忽视、其结果是当患者被医生告知可以再次妊娠时,妊娠后再次发生早期自然流产。反复流产导致一部分患者发生输卵管阻塞,双侧阻塞者因无法自然受孕,部分患者在医生建议下选择了辅助生殖,因为早期自然流产的男方因素并未得到解决,而辅助生殖技术进行精液处理过程中往往进一步加重精子DNA损伤,当患者花费了大量资金进行IVF或ICSI并再次妊娠后,结果仍然是发生早期自然流产。门诊的早期