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PDCD5及BCL-2在多发性骨髓瘤中表达【摘要】目的：研究促凋亡基因PDCD5和抑凋亡基因BCL-2在多发性骨髓瘤中的表达情况。方法：免疫组化及逆转录-聚合酶链反应方法（RT-PCR）检测31例及25例正常对照骨髓单个核细胞中PDCD5和BCL-2蛋白及mRNA的表达，用统计软件分析其表达水平之间的关系。结果：MM组PDCD5阳性细胞率（%）和染色强度指数（SII）均显著低于对照组，BCL-2阳性细胞率（%）和SII显著高于对照组，PDCD5蛋白和BCL-2蛋白阳性细胞率（%）呈负相关（r=-0.86，P0.05）。 MM组PDCD5 mRNA的相对表达水平显著低于对照组，BCL-2 mRNA的相对表达显著水平高于对照组，PDCD5、BCL-2 mRNA表达水平呈负相关（r=-0.90，P0.05）。结论：MM患者骨髓单个核细胞中，PDCD5蛋白、mRNA表达下调，而BCL-2蛋白、mRNA上调，二者表达水平呈负相关。 【关键词】PDCD5；BCL-2；多发性骨髓瘤 文章编号：1009-5519（2007）21-3184-04 中图分类号：R36 文献标识码：A 多发性骨髓瘤（MM）是浆细胞克隆性增生的恶性肿瘤,是一种低增殖性、低凋亡活性的分子克隆疾病，这一特点提示凋亡抑制可能在其发病中发挥了关键的作用。BCL-2是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，已经证实BCL-2为代表的凋亡抑制基因表达的上调和MM细胞寿命及化学药物抗性有关[1，2]。PDCD5是近年发现的凋亡相关新基因，实验表明PDCD5是促凋亡基因，有可能为一种新的早期凋亡的标志。本实验研究该基因在MM中的表达情况及其与BCL-2表达之间的关系。 1 资料与方法 1.1 研究对象：所有MM的骨髓均取自湘雅三医院2006年3月～2007年3月门诊及住院病人，共31例，其中男20例，女11例，年龄54～75岁，平均62岁，31例均为多次化疗后未缓解的病人。根据Bataille分期标准，Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期9例。另有非恶性血液病对照组25例，其中男17例，女8例，年龄49～73岁，平均58岁，所有入选对象均排除自身免疫性疾病、恶性肿瘤等可能影响PDCD5和BCL-2表达的疾病。 1.2 实验方法：（1）骨髓单个核细胞分离：按照淋巴细胞分离液说明书分离骨髓单个核细胞，显微镜下计数，调整细胞浓度至3～6×109/L，备用。（2）免疫组织化学染色：细胞悬液滴片，4%多聚甲醛-PBS液室温下固定30分钟，PBS液洗涤5分钟×3次，按照SP-9000试剂盒介绍方法进行实验，以0.01×PBS液代替一抗作为空白对照。结果判断：PDCD5及BCL-2 阳性染色均为胞浆内棕黄色颗粒。每张滴片观察500个细胞，分别计数PDCD5及BCL-2染色阳性的细胞，染色强度分为4级，即阴性、弱阳性、阳性及强阳性，分别记0、1、2、3分，计算阳性细胞百分比，并以每一强度的细胞数目计算细胞染色强度指数（staining intensity index,SII）SII=[3](阴性细胞数×0)+(弱阳性细胞数×1)+(阳性细胞数×2)+(强阳性细胞数×3)。（4）RT-PCR法：选择β-actin基因为内参，PRIMER5软件设计BCL-2及PDCD5、β-actin引物，由上海生物工程技术有限公司合成。引物序列如下：（1）Bc1-2：上游引物：5-ACACTGTTAAGCATGTGCCG -3’；下游引物：5-CCAGCTCATCTCACCTCACA-3’ 318bps。（2）PDCD5：上游引物：5-CGGA- ATTCACCATGGCGGACGAGGAGC-3’；下游引物：5-CGGA- ATTCAATAATCGTCATCTTCATC-3’ 395bps。（3）β-actin上游引物：5-ctccatcctggcctcgctgt-3’；下游引物：5-gctgtcaccttcaccg- ttcc-3’ 268bps。 总RNA的提取、cDNA的合成、PCR扩增步骤参照试剂盒说明书。PCR产物分析： 1.5%琼脂糖凝胶电泳在85V电压下电泳60分钟，SYNGENE凝胶图像处理系统扫描并读取灰度值，以PDCD5、BCL-2与β-actin灰度值的比值作为PDCD5、BCL-2 mRNA的相对表达水平，各标本重复2次，取平均值。 1.3 统计学处理：结果用均数±标准差(x±s)表示，两样本均数的比较采用t检验， PDCD5和BCL-2的阳性细胞率和mRNA相对表达水平的相关性用Pearson直线相关检验，P0.05为差异有统计学意义，所有数据均用SPSS13.0统计软件进行处理。 2 结果 2.1 MM与对照组PDCD5、B