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关于禽流感病毒检测方法研究及讨论【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)08－0270－01 【摘要】禽流感病毒的检测方法主要分为血清学检测和分子生物学检测两大类。血清学检测方法包括琼脂凝胶扩散试验(AGP)、血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验( ELISA)、神经氨酸酶抑制试验(NIT)和病毒中和试验(VN)。分子生物学检测方法包括RT-PCR、多重RT-PCR、多种改进的RT-PCR和基因探针技术。 【关键词】禽流感病毒;检测;血清学;分子生物学 禽流感病毒(AIV)属于正黏病毒科(orthomy xoviridae)流感病毒属,是一种A型流感病毒。A型流感病毒感染人、猪、马、海豹、水貂、鲸及所有禽类。在正黏病毒科中A型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型。禽流感病毒呈世界性分布,绝大多数禽流感病毒为隐性感染,感染动物不表现任何临床症状,只有少数禽流感病毒具有迅速传播和高致死性的特性,称之为高致病性禽流感病毒(HPAIV)。 ? 1 血清学检测 目前世界上普遍接受的检测禽流感病毒及抗体的标准方法有血清学诊断方法,如琼脂凝胶扩散试验(AGP)可鉴定病毒或检测型特异性的血清抗体或基质蛋白(matrix protein，MP);红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)可鉴定病毒或血清抗体的亚型;神经氨酸酶抑制试验(NIT)可鉴定病毒或血清抗体亚型等。采用鸡胚中和试验鉴定病毒或血清抗体的亚型也是一种可以接受的方法,但相对于HI繁琐。 ? 2 分子生物学检测技术 2.1 RT-PCR 该方法的基本原理是将从病料或鸡胚尿囊液中抽提出的禽流感病毒RNA作为模板,以所设计的上游引物为引物,加入反转录酶和dNTP于适合的缓冲液和温度下合成cDNA(即反转录的过程)。再以该cDNA为模板,加入根据目的片段设计的上、下游引物,在DNA聚合酶作用下利用dNTP在PCR仪上合成新的DNA链,扩增过程以变性、退火和延伸为一个循环,经25个左右的循环,DNA的拷贝数理论上可达295个以上,即3355万倍,扩增产物的量已足够用琼脂糖凝胶电泳检测出来。 2.2 多重RT-PCR 在RT-PCR的基础上,再加入其他亚型或其他种病毒的特异性引物,以目的片段的不同长度相区别,可同时诊断多个亚型或多种病毒,使检测的效率和适用性大大提高。研究建立了禽流感病毒(AIV)A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及H5/N1、H9/N2、A/H5/N1多重RT-PCR检测技术,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为临床样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。 2.3 改进RT-PCR 在RT-PCR核酸扩增的基础上,通过再次扩增或利用特异性核酸探针联合另一种检测方法,将信号扩大2次发展起来的RT-Nested PCR、实时荧光定量RT-PCR、电化学发光法、RT-PCR-ELISA等方法,进一步提高了敏感性和特异性。在这些方法中,禽流感病毒A型检测的灵敏性已略高于病毒分离法的水平(有些达0.150%鸡胚感染量),H亚型检测的灵敏性略低或相当于病毒分离法。其中一些方法的敏感性已能满足直接从病料中检测出病毒亚型的要求。 2.3.1 巢氏PCR法(RT-Nested PCR) 该方法灵敏度高,可检测到0.2 pg的病毒核酸,能适用于临床样品的检测。 2.3.2 实时荧光定量RT-PCR 该方法是近几年发展起来的新技术,既保持了PCR技术灵敏、快速的特点又克服了假阳性和不能定量的缺点。目前主要有4种方法用于DNA扩增产物的检测:双链DNA结合染料法、分子信标(molecular beacon)法、杂交探针法、Taq Man探针法。应用一步法RT-PCR和荧光水解型探针,引物设计参照禽流感病毒HA基因序列,可用于检测A型禽流感病毒和及其H5、H7两个亚型。其敏感性很高,可从低至10 fg(约1000个)的靶RNA分子或0.150%鸡胚感染量的病毒中检测出A型,可从低至100 fg(约1000~10000个)的靶RNA分子中检测出H5、H7亚型。将1550个气管或泄殖腔拭子的检测结果与传统病毒分离的方法相比,型鉴定结果相符率为89%(其余样品仅有一种方法的结果呈阳性);H5、H7亚型的鉴定结果则与病毒分离的方法基本一致。 2.3.4 RT-PCR-ELISA 本方法通过ELISA将信号进一步放大,并有探针特异性结合,与普通PCR方法相比,特异性和敏感性大大提高,敏感性方面已超过了鸡胚分离法。通过该法对禽流感病毒弱毒株(H5N2、H7N1亚型)进行检测,与鸡胚分离法相比阳性率高出39%。 2.4 基因探针检测技术 2.4.1 地