孕酮对视网膜缺血再灌注损伤神经元凋亡影响.doc

孕酮对视网膜缺血再灌注损伤神经元凋亡影响[摘要] 目的：研究孕酮预处理对视网膜缺血再灌注损伤后神经元凋亡的影响，并探讨其对视神经保护的可能机制。方法：用升高眼压的方法制作兔视网膜缺血再灌注模型，将36只新西兰大白兔随机分为正常组（n=4）、对照组（n=16）和孕酮组（n=16）。缺血再灌注模型制作前24 h，给予对照组兔耳缘静脉注射生理盐水4 ml/kg，孕酮组兔耳缘静脉注射孕酮4 mg/kg。观察缺血再灌注后不同时段对照组与孕酮组视网膜组织学变化和Bcl-2的蛋白表达及凋亡情况。结果：视网膜缺血再灌注各时间段，HE染色显示，孕酮组视网膜内层厚度均较对照组厚，且内核层细胞数较多，差异均有统计学意义（均P 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 选择新西兰大白兔36只，由重庆医科大学实验动物中心提供，体重2.0~2.5 kg；随机分为正常组4只，孕酮组和对照组，各16只，孕酮组和对照组再依不同再灌注时间，各按造模后12、24、48、72 h分为四组，各组4只。 1.2 试剂与仪器 试剂：孕酮注射液、速眠新（长春军需大学兽医研究所提供），链霉卵白素―过氧化物酶（HistostainTM－SP）免疫组化试剂盒、TUNEL试剂盒（ROCHE公司提供），兔多抗Bcl-2 IgG （武汉Boster公司提供）。仪器：GD-8型多媒体彩色图像病理分析仪。 1.3 模型建立 采用常规饲养新西兰大白兔。对照组和孕酮组分别在缺血前24 h肌内注射4 ml/kg生理盐水和4 mg/kg孕酮，1%地卡因滴眼局部麻醉，并给予速眠新0.3 ml/kg耳缘静脉注射。麻醉成功后将大白兔置于兔架固定器上固定，将连接生理盐水瓶输液管的4号半针自大白兔角膜缘穿入前房固定，升高输液瓶至与眼球垂直距离150 cm处（14.63 kPa眼内压），使网膜血管断流，可见球结膜苍白外观，维持1 h，遂将输液瓶高度渐放低，至兔眼球水平，恢复视网膜血供。 1.4 标本制作 给予0.3 ml/kg速眠新耳缘静脉注射麻醉动物，摘除眼球并编号。眼球于4%多聚甲醛固定6 h，只保留眼球视网膜，放入10%和20%蔗糖溶液内各2 h，30%蔗糖溶液内过夜；OCT包埋剂填充眼球，沿矢状面作连续5 μm切片；HE染色并于光镜下观察对照组和孕酮组视网膜细胞在不同时间点的形态变化，测量从内界膜到内核层间的长度。 1.5 免疫组化法检测Bcl-2蛋白表达 采用0.3% H2O2室温处理切片10 min，蒸馏水洗3次，浸入pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液中，加热达98℃断电，95~98℃ 处理30 min，冷却后滴加山羊血清封闭液，处理20 min，加Bcl-2 多克隆抗体，4℃过夜，PBS洗3次，加入生物素化羊抗兔IgG，37℃处理90 min，PBS洗3次，加试剂S-A/RP，37℃处理30 min，PBS洗5次，DAB显色10 min后脱水、透明、封片。 1.6 凋亡检测 采用新制备的4%多聚甲醛溶液室温下固定切片30 min，PBS洗片，放入0.3%H2O2溶液中恒温处理10 min，PBS洗3次；将其置于新配制的4℃ 0.1% Triton X-100及0.1% 枸橼酸钠缓冲液中各处理5 min，PBS洗3次；加TUNEL混合反应液，37℃处理60 min，PBS洗3次；滴加Converter-POD，37℃处理30 min，PBS洗6次，每次洗5 min；DAB显色15 min，中性树胶封片。阳性对照组于反应体系前用DNA酶Ⅰ消化，阴性对照组不加末端核糖核酸转移酶。 1.7 观察指标 于光镜10×40视野下进行结果观察，每只眼球取4张片观察，每张切片取4个视野。HE染色：测量从内核层到内界膜间的长度，并计数内核层每100 μm长视野内的细胞数；计量每100 μm长视野内表达Bcl-2和凋亡阳性细胞数。 1.8 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，以P 孕酮可减轻神经缺血-再灌注后的神经元凋亡，而上调Bcl-2表达可能是其发挥神经元保护作用的分子机制之一，作为一种自身合成的神经甾体激素，孕酮具有不良反应小的特点，是一种潜在的有应用前景的神经保护药物。 [参考文献] [1] Qiao SH, Chi HF. Effect of erythropoietin on neutronal apoptosis and caspase-2 expression after retinal i