巢式RT-PCR检测抗癌中药对结肠癌患者外周血CEA mRNA表达作用.doc

巢式RT-PCR检测抗癌中药对结肠癌患者外周血CEA mRNA表达作用[摘要] 目的：分析外周血中癌胚抗原信使核糖核酸(CEA mRNA)在诊断结肠癌血行转移中的应用价值，评价抗癌中药“卡宁”对结肠癌的疗效。方法：选取结肠癌患者40例作为研究对象，随机分为对照组与实验组，每组20例，应用巢式-逆转录-聚合酶链反应技术(巢式RT-PCR)检测患者服用“卡宁”前后血CEA mRNA的含量。结果：结肠癌患者治疗前，实验组CEA和CEA ｍRNA阳性率分别为32.5％、60.0％；对照组分别为37.5%、55.0％。治疗后，对照组患者CEA和CEA mRNA的阳性率分别为30%、45%；实验组分别为29.6%、41.2%(P＞0.05), 实验组治疗前后CEA与CEA ｍRNA含量有显著性差异(P B: 5’ -TGTAGCTGTTGCAAATGCTT TAAGGAAGAAGC-3’; C: 5’ -GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG-3’ PCR反应在两个体系中进行，第1轮引物为A+B，第2轮引物B+C， PCR产物长度为132 bp。 ②内参照β-actin引物。 上游引物：5’-CATTGTGATGGACTCCGGAGACGG-3’； 下游引物：5’-CATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAGC-3’ PCR产物长度为232 bp。 1.2.3 逆转录反应1 μg的标本RNA和100 ng逆转录引物在70℃下变性5 min，然后加核酸酶抑制剂25 U（Promega公司），4种核苷酸（dNTP）0.5 mmol/L，逆转录酶2 U，在42℃下反应60 min。 1.2.4 聚合酶链反应第1轮PCR以逆转录产物2 μl，加引物A+B，dNTP 200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，在PCR扩增仪上，94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，扩增35个循环。第2轮PCR以第1轮PCR产物2 μl，加引物B+C，其他条件同第1轮，扩增30个循环，然后72℃延伸10 min。每次扩增均设空白阴性及阳性对照。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以分子量标准带鉴别PCR产物位置。 1.2.5 CEA的测定应用ELISA测定结肠癌患者血清癌胚抗原(CEA)水平，以临床参考值＞5 μg/Ｌ作为阳性标准。 1.3 统计学方法 两组间比较采用ｔ检验，两样本间的比较采用χ2检验，采用SPSS统计学软件对数据进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 PCR电泳结果 第2轮PCR产物电泳图谱见图1。 图1 第2轮PCR产物电泳图 M：DNA分子量Marker；1-3：分别为患者甲、乙、丙治疗后扩增产物；4-6：分别为患者甲、乙、丙治疗前扩增产物 2.2 治疗前CEA mRNA检测结果 各组结肠癌治疗前CEA mRNA的检测结果见表1。 由表1可知，与健康对照组比较，结肠癌患者组中淋巴结转移和远处转移的阳性率差异均有显著性(总4组间比较χ2=28.766，P=0.000)。 结肠癌患者ELISA和RT-PCR检测结果比较见表2。应用ELISA测定结肠癌患者血清癌胚抗原(CEA)水平，以临床参考值＞5 μｇ/Ｌ为阳性标准；RT-PCR检测CEA ｍRNA。表2结果提示，CEA ｍRNA的阳性率高于CEA，差异有显著性(Ｐ＜0.05)。 正常人CEA ｍRNA的阳性率为0。在初诊结肠癌患者体内CEA和CEA ｍRNA的阳性率分别为32.5%和60.0%。 由表2可知，实验组治疗前后CEA与CEA mRNA均有显著差异(P [1]Sadahiro S, Suzuki T, Tokunaga N, et al. Detection of tumor cells in the portal and peripheral blood of patients with colorectal carcinoma using competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction [J]. Cancer,2001,92(5):1251-1258. [2]钱俊,钱宝珍.胃癌腹腔CEA和CK-20 ｍRNA检测的研究进展[J].医学分子生物学杂志,2004,1(5):320-322. [3]Jonas S, Windeatt S, Boateng A. Indentification of carcino-enbryonic antigen producing ce