诺如病毒标本处理和试验室检测技术方案.DOC

附件4 诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案 诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。Real-time RT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。 一、标本前处理 1.粪便、呕吐物 1.1设备和材料 微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5 ml无菌离心管、10 mM pH值为7.0－7.4的PBS。 1.2 操作方法 （1）离心管每管分装0.5 mlPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 g），稀释成约10％至20％（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500 μl的样品。 （2）漩涡振荡每个样品1 min。在2 400 g下离心5 min，使得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于－70℃。 （3）取澄清的上清液200 μl进行RNA提取。 2.水 通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05 M甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep 100TM 或 CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。 2.1设备和材料 DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、Millipore HA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20℃、-70℃）、Microsep 100 K columns（PALL公司）、Centriprep YM-50（Millipore公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、氯仿、丁醇。 2.2操作方法 2.2.1过滤装置准备 （1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有3层，型号分别为Millipore HA filter、AP15和AP20，放置顺序为Millipore HA filter →AP15 →AP20。 注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的那边向下。所有的玻璃器皿应干净无菌。每批水样使用不同的漏斗。 （2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。 （3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。 （4）真空泵连接1 000 ml的锥形瓶。 注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作。 （5）向滤器中倒入20 ml无菌水（DEPC水）检查滤膜的密封情况。 （6）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。 2.2.2 水样品的过滤 （1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。 （2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。 2.2.3 用酸漂洗滤膜 将膜用无菌的镊子夹放在有200 ml0.05 mM H2SO4（pH3.0）的无菌500 ml烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+。 2.2.4 洗脱 （1）将膜夹出放在无菌的60mm培养皿中，加5ml 洗脱液。盖上铝箔。 注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。 （2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速0.01g（45rpm），室温（23℃± 3℃），15min。 （3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。 2.2.5 中和洗脱液 用1 N HCl或1 N NaOH调整洗脱液的pH到7.0－7.4。检测前，洗脱液在－70℃储藏。 2.2.6 二次浓缩 方法一：用Microsep 100 K columns或Centriprep YM-50浓缩病毒 （1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。 （2）将水标本滤膜洗脱液（大约5 ml）加入到浓缩柱中，2 400 g离心5 min。 （3）吸取浓缩液（约150 μl），转移至1.5 ml离心管中。 方法二：PEG沉淀 （1）向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3 mol/L（若洗脱液为5ml加0.08775g的NaCl）, 有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5％（w/v）（若洗脱液为5 ml，加0.0625g的PEG-6000。4 ℃过夜。 （2）4 ℃，9 600 g离心30 min，收集沉淀； （3）Millipore HA filter，倾倒并弃掉上清液。每个离心管添加150－500 μl pH7.2（±0.2）PBS重悬沉淀物。将离心管放置在离心管架上，为更好的让