适用于竹林土壤PCR_DGGE分析用微生物总DNA提取和纯化方法.docVIP

适用于竹林土壤PCR-DGGE分析用的微生物总DNA提取及纯化方法 摘要：为了获得完整、高纯度的竹林土壤微生物总DNA，采用改良的十二烷基硫酸钠-高对5种竹林土壤进行DNA提取，通过DNA凝胶回收试剂盒纯化粗提的DNA，利用细菌16 SrDNA基因的V3区引物对纯化的DNA进行了聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳 （PCR-DGGE）验证。结果表明，该方法所需土壤样品少，抽提的DNA片段均在23kb 以上，完整性好；采用DNA凝胶回收试剂盒纯化能够有效去除粗提DNA中大部分杂质， 获得高质量的DNA；以此DNA为模板进行DGGE检测所反映的微生物信息量丰富。变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE）技术从 1993 年被引入微生物生态学以来， 已经普遍应用于微生物研究， 成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具之一［1］。获得样品中所有种类微生物的 DNA 是应用 DGGE 技术的前提和关键。 然而， 来自环境中的样品含有非常复杂的成分， 尤其是土壤中的腐植酸类物质很难去除。 另外， 实际样品中微生物细胞壁的坚实度不同， 如不注意就会选择性地获得那些易破细胞壁的微生物 DNA， 而且有些样品 DNA 回收率低， 造成重复性降低［2］。 因此， 需要摸索适合具体样品的 DNA 提取方法。 近 30 a 来， 国内外在这方面作了大量研究， 如 Porteous 等［3］使用加热-酶-异硫氰酸胍裂解细胞提取总 DNA； Zhou 等［4］使用蛋白酶 K 和十二烷基 硫酸钠 （SDS）破 解 细 胞提取总 DNA。 这些方法提取的土壤微生物DNA 产量高， 但杂质也多， 其中以腐植酸污染最为严重， 直接影响后续聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）实验的准确性。 鉴于此， 人们又尝试许多方法去除腐植酸的影响， 如He 等［5］使用磷酸盐缓冲液预洗土壤后再提取 DNA， Dong 等［6］尝试采用 Al2（SO4）3去除土壤 DNA 中的腐植酸， 获得良好效果。 目前，针对竹林土壤微生物总 DNA 提取以及利用 PCR-DGGE 分析竹林土壤微生物群落多样性的研究还未见报道。 笔者拟在以往研究的基础上， 通过摸索和改进［4，7-8］， 建立一种适应于竹林土壤PCR-DGGE 分析用的 DNA 提取和纯化方法， 为进一步研究竹林土壤微生物群落结构和多样性打下良好的基础。 1材料和方法 1.1材料 实验土样于 2007 年 8 月取自浙江林学院吉永竹园。 分别采集了雷竹 Phyllostachys praecox， 紫竹Phyllostachys nigra， 刚 竹 Phyllostachys sulphurea， 龟 甲 竹 Phyllostachys heterocycla 和 黄 秆 乌 哺 鸡Phyllostachys vivax 等 5 种竹林的土壤， 采样深度为 0 ~ 10 cm， 按五点法采样， 四分法混匀放入保鲜袋中， 封口后， 带回实验室， 4 ℃保存。 1.2竹林土壤微生物总DNA提取方法 1.2.1粗提 首先按照 Zhou 等［4］ 报道的 SDS 高盐抽提法（简称常规法）提取了 5 种竹林土壤微生物的总 DNA， 作为对照。 采用的改良 SDS 高盐抽提法 （简称改良法）参照常规法修订而成， 即在高盐提取 液中添加石英砂， 以反复冻融代替水浴破碎细胞， 并且在氯仿-异戊醇抽提过程增加了 NaCl/CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）溶液 2 次抽提的步骤。 具体操作如下： 称取 1.0 g 土壤样品， 与 4.5 mL DNA提取缓冲液（Tris-HCl 100 mmol·L－1， EDTA 100 mmol·L－1， Na3PO4100 mmol·L－1， NaCl 1.5 mol·L－1， 10.0g·kg－1CTAB， pH 8.0） 混合， 加少许石英砂， 于 230 r·min－1摇床上 37 ℃摇动 30 min； 随后加入 0.5mL 200 g·kg－1 SDS， 混合物于 65 ℃水浴 20 min （每隔 10~15 min 轻轻上下颠倒几次）， － 80 ℃冷冻 15min， 反复冻融 2 次。 室温 6 000 r·min-1离心 10 min， 收集上清， 加入 1/10 体积 65 ℃预热的 NaCl/CTAB 溶液 （100 g·kg－1CTAB， 0.7 mol·L－1NaCl）和等体积的氯仿-戊醇， 轻摇混匀， 室温下 10 000r·min-1离心 6 min， 吸取上层水相。 重复抽提 1~2 次， 吸取水相转移至新离心管中， 加入 0.6 倍体积的异丙醇， 室温沉淀 15 min， 10