基因工程载体vector.ppt

基因工程发展史有关的重要事件 第二节 基因工程的工具酶 定义：凡在基因工程中应用的酶统称为工具酶。 一、限制酶 (restrict enzymes) （一）限制与修饰现象 大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制(restriction)和修饰(modification)现象，简称R/M体系。 作用：一是保护自身的DNA不受限制，而是破坏外源DNA使之迅速降解。 （二）限制酶的命名和分类 定义：凡在识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。 （1）限制酶命名： （三）第Ⅱ型限制酶的作用性质 1、基本特性： （1）识别位点为4~8个核苷酸序列； （2）识别位点即为切割位点； （3）位点上核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构，即呈回文结构。 切割方式通常有三种： ①在识别顺序两条链对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成齐平末端。如HaeⅢ， PvuII。 ②在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从5‘ 端切断磷酸二酯键，形成5‘ 磷酰基端2~5个核苷酸单链粘性末端。如EcoRⅠ。 ③在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从3‘ 端切断磷酸二酯键，形成3‘羟基端2~5个核苷酸单链粘性末端。入PstⅠ。 第三节 基因工程载体（vector） 能将目的基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子谓之为基因工程载体 相关概念 有用基因亦称为目的基因或插入物 用于接受重组DNA的扩增载体及其插入物或表达目的基因的受体细胞谓之宿主 插入物的扩增过程称为分子克隆 携带重组DNA分子的宿主为基因工程细胞（菌）或重组细胞（菌） 基因工程载体的必备条件 1、具有有效运载能力 2、携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制 3、在宿主内能控制外源基因表达活动 4、坚定方便，装卸手续简单 5、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小, 载力要大 6、容易控制、安全可靠、稳定性好 三大类基因工程载体 细菌质粒 病 毒DNA 基因真核表达 植物表达（烟草花叶病毒） 动物表达（腺病毒） 噬菌体DNA 一、细菌质粒 ㈠、质粒的生物学性质 环形双链质粒分子具有三种不同构型 1、共价闭合环形DNA（SCDNA）：两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构; 2、开环DNA（OCDNA）：两条链中只有一条保持完整环形结构，另一条链出现一至数个缺口; 3、线性分子DNA（LDNA）通称L构型：质粒DNA经过适当的核酸内切酶切割后，发生双链断裂而形成; pBR322由三个不同的部分组成 1、来源于pSF2124质粒易位子Tn3的ampr 2、来源于pSC101质粒的tetr 3、来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点 五、原生质体融合 通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。 经过细胞膜融合，细菌内容物能转入动物细胞中，质粒DNA被转移到细胞核中。 六、脂质体法 将DNA包裹于脂质体微囊中，然后，进行脂质体微囊与宿主细胞膜融合，将外源DNA导入。 将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中，此法多用于转基因动物。 七、细胞核的显微注射法 八、激光打孔技术 用激光束在细胞上打孔，使溶解在高渗溶液中的DNA进入细胞内部。 第六节 阳性重组DNA的鉴别与分析 一、阳性重组DNA的鉴定 （一）表现型分析法 抗生素抗性基因分析法 抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有Ap的平板 再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子 Ap 影印 挑选 Ap + Tc X-gal显色反应筛选重组体 pUC18 Ap r lacZ ori Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-） 将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落 显色筛选法的基本操作： （二）原位杂交技术（in situ hybridization） 根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组 转化体菌落位置的技术称之为原位杂交技术。 影印 洗涤 杂交 感光 原位杂交技术方法图示 原位杂交技术步骤 生长着转化菌落或嗜菌斑的平板→原位转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，得到一个与平板菌落或嗜菌斑分布完全一致的复制品→ 裂解