生物技术制药试验-武汉大学药学院.doc

生物技术制药实验 武汉大学药学院 生物技术实验室 湖北·武汉  目 录 实验一 质粒DNA的小量制备 实验二 质粒DNA电泳鉴定 实验三 感受态细胞的制备和转化 实验四 目的基因的表达及表达产物的初步提取 实验五 蛋白质纯化—盐析沉淀法 实验六 凝胶过滤层析 实验七 蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting） 实验八 HRP结合物的过碘酸钠交联法  实验一 质粒DNA的小量制备 【目的】 学会最常用的碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 【原理】 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0(12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA等发生共沉淀下去而被去除。 【器材】 超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。 【试剂】 pET-28a质粒载体菌, LB培养基1000ml（含10(g/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液 （溶液 II），KAc溶液（pH4.8）（溶液 III），RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。 【实验准备】 1. 配制卡那霉素储存液（无菌水配制10mg/ml，分装后-20(C保存）。 2. 配制LB培养基 （胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL 双蒸水搅拌完全溶解，用约200(L 5N NaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L，121(C灭菌20min）。 3. 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）。 溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。 溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）； 溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补双蒸水至100ml）。 4. 70%乙醇（-20(C保存）。 5. TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA ，pH8.0）。 6. 试管洗净并塞上棉塞，1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，高压灭菌（121(C， 30min）。 【操作步骤】 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的试管中。 取出保存的携带pET-28a质粒的菌种, 在超净工作台上用接种环移取少量菌种至5ml无菌的LB培养液（含10ug/ml卡那霉素）中，37(C摇床中振荡培养20h。 取1ml的菌液至1.5ml离心管中，12000 rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。 在沉淀中加入预冷的100(l 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散。 加入200(l 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。切勿剧烈振荡。冰浴中放置5min。 加入预冷的150(l 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，冰浴放置5min。 12000 rpm离心5min，小心吸取400(l 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800(l 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500(l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，倒置尽量流尽。 再加入500(l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。 离心管倒置于37(C温箱中（或室温）空气干燥10分钟。 加入10(LTE缓冲液，涡旋混合器上轻微振荡混匀，离心机中瞬时离心将溶液收集于管底。用记号笔标记后放入冰箱中冷藏待电泳确认。 在剩余的菌液中倒入少许新洁尔灭，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器。 撰写实验报告。 【思考】 影响本实验结果的主要因素有哪些？ 实验二 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA 【目的】 学会常用的琼脂糖凝胶电泳法分离和鉴定DNA。 【原理】 DNA双螺旋分